cellranger更新到5啦（全新使用教程）

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目前单细胞转录组以10X公司为主流，我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger全部使用细节及流程，大家可以自行前往学习，如下：

但是这个两年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger，在2020的7月我看到了其更新到了V4，也里面写了一个总结，见：cellranger更新到4啦（全新使用教程）

没想到这2020才结束，它马上有升级了，目前是Cell Ranger - 5.0.1 (December 16, 2020)，好像没有改变，其实并没有必要再总结一个笔记，但是反正也没有啥事情，就水一个吧！反正再怎么水，也比不上周运来的高产，仅仅是一个seurat的V4更新，就可以写十几篇笔记：

我们的这个cellranger更新，我就一篇就写完了！

软件下载及安装

同样的，需要自己简单注册后就可以获取wget下载地址，因为版权的问题，我这里就不复制粘贴出来地址啦，反正简单填写邮箱即可注册拿到地址。

注册网页是: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/downloads/latest

image-20210121102018059

一般来说，软件以及配套的数据库都需要下载，下载速度呢，就取决于你自己的网路情况啦，反正在中国大陆地区下载肯定会很慢的，建议nohup到后台，等一个晚上即可。

我看了看，在中国大陆广东省，可以跑满我的联通200M宽带，不存在速度问题。

再次认识10x的fastq数据文件

官网给指出来了文件名规则：https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/2.0/using/fastq-input#wrongname ，如果你的fastq数据不是这样命名，就需要自行更改过来了，我上面截图的就是需要修改的，因为里面混入了AK这样的编号。

如果要理解这3个文件的区别，同理，也是需要自己去学习了解10x的原理，我这里就不再赘述：

  • 首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；

  • 然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；

  • 最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads

使用Cell Ranger

Cell Ranger主要的流程有：拆分数据 mkfastq、细胞定量 count、定量组合 aggr、调参reanalyze，还有一些小工具比如mkref、mkgtf、upload、sitecheck、mat2csv、vdj、mkvdjref、testrun。

但是，大概率上，我们只需要使用它的定量流程，就是 cellranger count 命令，教程在consult Running 10x Pipelines on FASTQ Files，主要就是需要把软件和配套的数据库文件，以及10x的fastq文件准备好（主要就是命名符合规则）。

我写了一个脚本，文件名是 run-cellranger.shn，内容如下所示 :

bin=../pipeline/cellranger-5.0.1/bin/cellranger
db=../pipeline/refdata-gex-GRCh38-2020-A
ls $bin; ls $db

fq_dir=/home/data/project/10x/raw
$bin count --id=$1 \
--localcores=4 \
--transcriptome=$db \
--fastqs=$fq_dir \
--sample=$1 \
--expect-cells=5000

是不是超级简单，值得注意的是我把样本名字进行了修改，全部的技术含量都体现在这个文件名修改哦，才成功运行这个 cellranger count 命令。

然后每个样本都只需要提交上面的这个脚本即可：

nohup bash run-cellranger.sh YX-Endo-Decidu 1>log-YX-Endo-Decidu.txt 2>&1 &
nohup bash run-cellranger.sh YX-PBMC-Decidu 1>log-YX-PBMC-Decidu.txt 2>&1 &
nohup bash run-cellranger.sh HSY-PBMC 1>log-HSY-PBMC.txt 2>&1 &

nohup bash run-cellranger.sh HSY-fushui 1>log-HSY-fushui.txt 2>&1 &
nohup bash run-cellranger.sh HSY-yi 1>log-HSY-yi.txt 2>&1 &

服务器配置不一样，这个cellranger count流程运行时间不一样，我 一个样本是60G的fq文件数据走这个流程是5小时。

如果你真想学会Cell Ranger - 5.0.1

首先你需要有单细胞转录组数据，其次你需要有强大的服务器。如果是普通的R语言教程，当然是可以提供测试数据，但是我们的这个单细胞转录组数据，实在是太大了，如果一定要分享，只能说是跟服务器搭配分享，如下所示：

paper-rawData-30g/SRR7722937_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722937_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722937_S1_L001_R2_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722938_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722938_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722938_S1_L001_R2_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722939_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722939_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722939_S1_L001_R2_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722940_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722940_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722940_S1_L001_R2_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722941_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722941_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722941_S1_L001_R2_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722942_S1_L001_I1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722942_S1_L001_R1_001.fastq.gz
paper-rawData-30g/SRR7722942_S1_L001_R2_001.fastq.gz

你可以考虑我们的共享云服务器，来一起体验这个Cell Ranger - 5.0.1的单细胞转录组上游分析流程。

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