01

CHIP-seq第三讲之使用MACS软件寻找peaks

在使用Bowtie比对于完Chip-Seq的结果后,就需要用到MACS或者ERANGE来找出峰所在的位置了。但是由于ERANGE的设置比较复杂,所以最为流行的还是MACS。

一.首先安装MACS软件

MACS有两个版本,分别是MACS14和MACS2。MACS2在很多方面都对MACS14做了重大改进,但目前还在测试阶段。我们依然以MACS14为例进行说明。

MACS软件的下载地址在wget https://codeload.github.com/taoliu/MACS/zip/master

这是一个python软件,有152M,已经算是很大了!所以需要按照安装python的方法来安装它!但是,好像这个是最新版的,我们还是用1.4版本吧

wget http://github.com/downloads/taoliu/MACS/MACS-1.4.2-1.tar.gz

其实它的readme已经把这个软件的各种安装使用方法讲的很清楚了。

https://github.com/taoliu/MACS/blob/master/README.rst

MACS软件的具体原理,大家去看文献,或者参考这篇文章

http://www.plob.org/2014/05/08/7227.html

很简单的一个python命令即可安装该软件python setup.py install --user

CHIP-seq第三讲之使用MACS软件寻找peaks752

二.然后准备该软件所需要的数据

是我们在前两篇文章中提到的数据

CHIP-seq第三讲之使用MACS软件寻找peaks786

三.接着运行MACS的命令

/home/jmzeng/.local/bin/macs14 -t Xu_WT_rep2_BAF155.fastq.trimmed.single.bam \

> -c Xu_WT_rep2_Input.fastq.trimmed.single.bam \

> -f BAM -g hs --bw 300 -w -S -n Xu_WT_rep2

CHIP-seq第三讲之使用MACS软件寻找peaks974

四.最后解读一下结果

CHIP-seq第三讲之使用MACS软件寻找peaks987

56K Apr 30 21:54 Xu_WT_rep2_model.r

5.5K Apr 30 22:21 Xu_WT_rep2_negative_peaks.xls

783K Apr 30 22:21 Xu_WT_rep2_peaks.bed

865K Apr 30 22:21 Xu_WT_rep2_peaks.xls

766K Apr 30 22:21 Xu_WT_rep2_summits.bed

唉,反正这也不是我的课题,懒得解释这些结果啦,等后来有机会再慢慢玩吧

 

 

参考 http://www.plob.org/2014/05/08/7227.html

附录:我们现在来了解如何设置参数。

参考自 http://www.plob.org/2014/01/26/7118.html

-t TFILE, –treatment=TFILE 输入文件名

-c CFILE, –control=CFILE 输入阴对文件名

-n NAME, –name=NAME 输入出文件名前缀

-f FORMAT, –format=FORMAT 输入文件格式,默认值为AUTO,可选的值为”BEG”,”ELAND”,”ELANDMULTI”,”ELANDMULTIPER”,”ELANDEXPORT”,”SAM”,”BAM”,”BOWTIE”等。

-g GSIZE, –gsize=GSIZE 比对模板大小。格式可以是:1.0e+9,或者1000000000,也可以缩写:’hs’ for 人类 (2.7e9), ‘mm’ for 大鼠(1.87e9), ‘ce’ for 线虫 (9e7) and ‘dm’ for 果蝇 (1.2e8), 默认值:hs

-s TSIZE, –tsize=TSIZE 设置为短序列的长度,默认值为25

-p PVALE, –pvalue=PVALUE 非峰可能性截取值,默认值为1e-5,这个值不能大太,超过0.9的话,可能无法输出正确的结果

-m MFOLD, –mfold=MFOLD 峰值高度相对于本底的比值,默认值为10,30。也就是说,最低值不能少于10,但比值超过30也不认为它是正常的一个峰。一般而言,低值设置为10是一个很好的区分点。如果这个值还是无法得到满意的结果,那么可以设置得更低,但最好还是使用–nomodel参数,使–nomodel设置为True,然后再传递–shiftsize及–bw参数给MACS。–shiftsize默认值为100,而–bw的默认值为300。

–diag 生成完整报表,会包括是否为真峰的可能性,但会严重拖累运算速度。

 

30

自学CHIP-seq第二讲之过滤数据并比对

这个是有着非常成熟的流程了,我就不细讲了!

我们随机挑选两个文件来跑一下CHIP-seq的流程吧,其中一个是.部分进行免疫共沉淀前的DNA(input DNA)作为空白对照。

5.5G Apr 30 10:31 Xu_WT_rep2_BAF155.fastq

18G Feb 13 20:37 Xu_WT_rep2_Input.fastq

首先进行质量控制,过滤低质量的reads

这里我选取的是DynamicTrim.pl 和

脚本如下

for id in *fastq

do

echo $id

perl DynamicTrim.pl $id

done

接下来

for id in *.trimmed

do

echo $id

perl LengthSort.pl $id

Done

这样就得到了过滤后的reads,可以进行比对啦!

图片1

当然,中间文件可以删掉啦,不然太占空间了,我还只是取了两个数据,要是把这个文章的八个数据都跑完就太纠结了。

然后用bowtie比对

#samtools faidx hg19.fa

#Bowtie2-build hg19.fa hg19

for i in *single

do

bowtie2 -x /home/jmzeng/ref-database/hg19 -U $i -S  $i.sam

samtools view -bS $i.sam> $i.bam

done

输出的bam文件就需要用MASC这个软件来找peak了

30

自学CHIP-seq第一讲之文献解读

我这里选择的CHIP-seq文章题目是

CARM1 Methylates Chromatin Remodeling Factor BAF155 to Enhance Tumor Progression and Metastasis

文章链接http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1535610813005369

这是2013年的文章,算是蛮新的了,主要探究了CARM1这个基因

然后我简单搜索了一些这个基因的信息

9606 10498 CARM1

- PRMT4

MIM:603934|HGNC:HGNC:23393|

Ensembl:ENSG00000142453|HPRD:09158|Vega:OTTHUMG00000180699

19 19p13.2 coactivator-associated arginine methyltransferase 1

protein-coding CARM1 coactivator-associated arginine methyltransferase histone-arginine methyltransferase CARM1|protein arginine N-methyltransferase 4 20150308

该基因是多种肿瘤相关的转录因子的共激活剂(激活蛋白;转录辅助激活蛋白;转录共同活化子)。

文章作者做了以下四件事

Knockout of CARM1 Using ZFN in Breast Cancer Cells

Identification of BAF155 as a Novel CARM1 Substrate

Methylation of BAF155 Promotes Tumor Growth and Metastasis

Methylated BAF155 Gains Unique Chromatin Association

 

所以就有两种细胞,一种是野生型WT,一种是突变的MUT细胞

然后它们分别做了两个重复,一种是input一种是BAF155免疫测序。

CHIP-seq一定是有一个input对照文件,和一个真正的免疫共沉淀的测序文件。

这样就有八个测序文件。

我们随机挑选两个文件来跑一下CHIP-seq的流程吧,其中一个是.部分进行免疫共沉淀前的DNA(input DNA)作为空白对照。

5.5G Apr 30 10:31 Xu_WT_rep2_BAF155.fastq

18G Feb 13 20:37 Xu_WT_rep2_Input.fastq

然后我随便在网上找了一个生信分析流程

  1. 标准信息分析
    a)   对测序数据进行base calling、raw data 数据整理及数据质量评估;
    b)   去接头污染,去低质量reads和产量情况统计
    c)   Bisulfite 测序序列与参考基因组序列的比对
    d)   深度和覆盖度分析
    e)   C 碱基的甲基化水平
    f)   全基因组甲基化水平分布趋势
  2. g)  全基因组DNA甲基化图谱
  3. h)  差异性甲基化区域(DMR)分析

 

参考

http://www.plob.org/2012/09/29/3760.html

http://www.plob.org/2012/01/09/1605.html

http://www.plob.org/2012/01/08/1538.html