看到2020年2月发表在nature cancer这个新杂志的文章《Single-cell analyses reveal increased intratumoral heterogeneity after the onset of therapy resistance in small-cell lung cancer》链接是：https://www.nature.com/articles/s43018-019-0020-z 里面有普通的18个样品的bulk转录组数据以及25个单细胞转录组数据。


主要是 (CTC)-derived xenografts (CDXs) ，听说过是技术难度很高！

首先是突变全景图很突兀，也很诡异

如下：

全文反正也没有提到如何测序，是WGS,WES还是说仅仅是 panel，没有突变数据分析的描述，仅仅是提到了BWA和VARSCAN软件而已，也不上传数据。这样的话，我们只能是假设研究者没有造假咯！
反正没有数据可以下载，而且作者描述的也超级简陋，做啥图表复现都不可能额！

单细胞呢，好像缺一个样品！！

单细胞的实验环节，正文里面说的倒是很清楚，是目前主流的10X商业化仪器的数据 ：
Sorted cells were washed once with 0.04% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline and counted on a Countess II automated cell counter (Thermo Fisher Scientific). A total of 12,200 cells were loaded per lane on the 10× Chromium platform and processed for complementary DNA synthesis and library preparation, per the manufacturer’s protocol using version 2 chemistry. Complementary DNA and libraries were checked for quality on an Agilent 4200 TapeStation and quantified by KAPA quantitative PCR before sequencing on a single lane of a HiSeq 4000 (Illumina).
数据分析细节如下：

完全没办法接受研究者的阈值，居然是表达的基因数量少于3000的细胞直接就过滤了！！！这个是10X商业化仪器的数据 啊~~~
而且明明是8个单细胞转录组的 CDXs 数据 ，正文也写了； t-SNE analysis of eight CDXs. 结论是： Cells from each CDX were more similar to themselves than to other models. 但是上传的数据呢，缺失那个 HCI开头的样品：

• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA575243
• https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA575243
  反正我找了很久，都是看不到的！
  
  这8个单细胞转录组数据的独立聚类分群如下：
  
  这些分析都超级简单，基本上单按照细胞基础10讲
• 01. 上游分析流程
• 02.课题多少个样品，测序数据量如何
• 03. 过滤不合格细胞和基因（数据质控很重要）
• 04. 过滤线粒体核糖体基因
• 05. 去除细胞效应和基因效应
• 06.单细胞转录组数据的降维聚类分群
• 07.单细胞转录组数据处理之细胞亚群注释
• 08.把拿到的亚群进行更细致的分群
• 09.单细胞转录组数据处理之细胞亚群比例比较
  一步步分析即可！

  虽然原始数据可以在EBI下载原始数据，但是缺关键信息

  根据 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138267 可以拿到ebi数据库链接，链接是：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJNA575243
  如下所示，每个单细胞样品，都仅仅是提供了一个fastq文件：
  
  其实前面我们提到过，10X的单细胞转录组原始数据的话， 比较特殊，它的测序文库中包括index、barcode、UMI和测序reads。

• 首先，1-26个cycle就是测序得到了26个碱基，先是16个Barcode碱基，然后是10个UMI碱基；
• 然后，27-34这8个cycle得到了8个碱基，就是i7的sample index；
• 最后35-132个cycle得到了98个碱基，就是转录本reads，需要拿去做比对的！
  作者仅仅是提供一个fastq文件，基本上可以定论，这样的数据没意义了。但是为了让我们的结论更保险，我还是亲自下载看看，可以参考：使用ebi数据库直接下载fastq测序数据 , 需要自行配置好，然后去EBI里面搜索到的 fq.txt 路径文件。这里演示一个数据的下载即可：

  conda activate download
  dsa=$HOME/miniconda3/envs/download/etc/asperaweb_id_dsa.openssh
  ls -lh $dsa
  nohup ascp -QT -l 300m -P33001 -i $dsa \
  era-fasp@fasp.sra.ebi.ac.uk:/vol1/fastq/SRR102/073/SRR10211573/SRR10211573.fastq.gz ./ &
  

  花了半个小时下载了这个接近 20G的数据，看了看前面的一点点：

  @SRR10211573.1 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27630:1261/2
  CATTTTGTANTACGGGGATACCTGNGACTGCACCNTTAAAAAATATATTTATCATTTAANTCTTGGGTAANCACACTTCATAACAGAGNAGAGNGANT
  +
  A<<-----<#--7--7---77A-7#7JJFAAJ7J#7-FF-<--<--77--77AF<----#-<<----<77#FJ-<-AJ--7--7-7--#-7-<#--#-
  @SRR10211573.2 K00384:78:HLM37BBXX:3:1101:27813:1261/2
  AGTGAATCCNAATACTTACAGCCCNCTGATGTGCNCCAAAGTAAACAAAAACAATGATGNTAATGGACACNCTCTTCAATATACTAGGNGGAGNGGNG
  +
  A---<<---#--<A<<F<F-FFF-#7-7---7-<#---7F<-AA<F-<-AAFJF---7-#-AF-7-7-7A#F7-777-----7---<-#-7--#7-#7
  

  很正常的转录本reads数据信息，但是缺Barcode文件信息。 假如作者提供的10x数据是合格的，就可以走我们的流程即可，参考我在《生信技能树》的教程：cellranger更新到4啦（全新使用教程）

  目前单细胞转录组以10X公司为主流，我们也是在单细胞天地公众号详细介绍了cellranger流程，大家可以自行前往学习，如下：

• 单细胞实战(一)数据下载
• 单细胞实战(二) cell ranger使用前注意事项
• 单细胞实战(三) Cell Ranger使用初探
• 单细胞实战(四) Cell Ranger流程概览
• 单细胞实战(五) 理解cellranger count的结果
  但是这个两年前的系列笔记是基于V2,V3版本的cellranger，目前呢它更新到了版本4，建议以我的最新版教程为准，在《生信技能树》的教程：cellranger更新到4啦（全新使用教程）

  唯一可利用的居然是表达矩阵

  作为学徒作业吧，大家进入 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE138267 下载全部的表达矩阵，走一下文章里面的聚类分群看看，重复性如何！
  
  每个样品都是一个独立的压缩包，都是3个文件，如下：
  
  走我们一直强调的10X数据处理全套代码即可。
  检查是不是缺失一个样品，是不是表达的基因数量少于3000的细胞之间就过滤了？