甲基化基础补充

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最近我在《生信技能树》安排了两个甲基化相关的学徒作业：

有学徒表示虽然看了我在B站免费分享的视频课程《甲基化芯片（450K或者850K）数据处理 》，详见：免费视频课程《甲基化芯片数据分析》，但是课程过于强调实操，很多背景知识大家比较缺乏，所以学徒自告奋勇补充了一些甲基化基础知识，供大家学习！

DNA甲基化

  • 定义：DNA甲基化(DNA methylation)是研究得最清楚、 也是最重要的表观遗传修饰形式，主要是基因组 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)
  • 哺乳动物基因组中5mC占胞嘧啶总量的2%-7%，约70%的5mC存在于CpG二连核苷
  • 在结构基因的5’端调控区域, CpG二连核苷常常以成簇串联形式排列，这种富含CpG二连核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)，其大小为500-1000bp，约56%的编码基因含该结构
  • 影响：基因调控元件(如启动子)所含CpG岛中的5mC会阻碍转录因子复合体与DNA的结合
    • DNA甲基化一般与基因沉默相关联
    • 非甲基化一般与基因的活化相关联
    • 而去甲基化往往与一个沉默基因的重新激活相关联

DNA甲基化状态的遗传和保持：

  • DNA复制后，新合成链在DNMT1的作用下，以旧链为模板进行甲基化。（缺乏严格的精确性，95%）
  • 甲基化并非基因沉默的原因而是基因沉默的结果，其以某种机制识别沉默基因，后进行甲基化

  • DNA全新甲基化引发因素可能包括：

  • DNA本身的序列、成分和次级结构

    • RNA根据序列同源性可能靶定的区域
    • 特定染色质蛋白、组蛋白修饰或相当有序的染色质结构

DNA去甲基化：

  • 主动去甲基化：

  • 复制相关的去甲基化：在复制过程中维持甲基化酶活性被关闭或维持甲基化酶活性被抵制。

全新甲基化|甲基化状态保持|去甲基化：

0QY7Md.png

DNA甲基化的分布：

  • 转座子
  • 逆转录病毒衍生的重复序列
  • 大多数功能基因的编码区

Roles of DNA methylation:

  • gene silencing: 0Qthmn.png

  • Impriting: 0Qtv01.png

  • Marking active regulatory elements:0QNptK.png

  • Alternative promoter regulation: 0QNkXd.png

  • silencing of repeats: 0QNntf.png

甲基化芯片

甲基化芯⽚主要是450K和850K，都是采⽤了两种探针Infinium Ⅰ 和Infinium Ⅱ对甲基化
进⾏测定；

  • Infinium I采⽤了两种bead（甲基化M和⾮甲基化U）

  • II只有⼀种bead（即甲基化和⾮甲基化在⼀起）

这也导致了它们在后续荧光探测的不同，450K采⽤了两种荧光探测信号（红光和绿光）。

850k

编码区域与增强子区域范围广泛覆盖的唯一组合

每份样本分析超过850,000个甲基化位点，可达单核苷酸分辨率

● 实验分析方法可重现性高

技术平行重复性＞98%

● 简单的工作流程

PCR-free（无需聚合酶链式反应）的操作，结合强大的Infinium HD Assay实验分析方法

● 与福尔马林固定、石蜡包埋样本兼容

可提供适用于福尔马林固定、石蜡包埋样本的甲基化研究实验方案

0QR94e.png

Infinium MethylationEPIC BeadChip芯片基于业界领先的Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片的基础上开发，包含原有90%以上的CpG，外加新增的350,000个位于增强子区域的CpG。该实验分析方法能够在单个CpG位点的水平上提供定量甲基化测量，可适用于正常及福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）样本，为深入了解表观遗传变化提供了强大的检测分辨率。

表达谱芯片 甲基化芯片
.cel .idat
基因表达矩阵 甲基化信号矩阵

下载甲基化芯片的两种方式

  • 下载原始idat原始文件：
library(GEOquery)
getGEOSuppFiles("GSE68777") #或者自己上官网下载

untar("GSE68777/GSE68777_RAW.tar", exdir = "GSE68777/idat") # minfi ⽆法读取压缩的idat⽂件，所以需要解压
head(list.files("GSE68777/idat", pattern = "idat"))
idatFiles <- list.files("GSE68777/idat", pattern = "idat.gz$", full = TRUE)
rgSet <- read.metharray.exp("GSE68777/idat")
rgSet
save(rgSet,file = 'GSE68777_minfi_rgSet.Rdata')
  • 下载甲基化信号值矩阵:
require(GEOquery)
require(Biobase)
GSE80559 <- getGEO("GSE80559")
beta.m <- exprs(GSE80559[[1]])

甲基化信号值矩阵3个层次的差异分析

  1. DMP:DMP代表找出Differential Methylation Probe（差异化CpG位点）
  2. DMR:DMR代表找出Differential Methylation Region（差异化CpG区域）
  3. DMB:Block代表Differential Methylation Block（更⼤范围的差异化region区域）
专有名词 概念
beta One single beta matrix to do filtering. (default = myImport$beta).
M One single M matrix to do filtering. (default = NULL).
pd pd file related to this beta matrix, suggest provided, because maybe filtering would be on pd file. (default = myImport$pd)
intensity intensity matrix. (default = NULL).
Meth Methylated matrix. (default = NULL).
UnMeth UnMethylated matrix. (default = NULL).
detP Detected P value matrix for corresponding beta matrix, it MUST be 100% corresponding, which can be ignored if you don’t have.(default = NULL)
beadcount Beadcount information for Green and Red Channal, need for filterBeads.(default = NULL)

Beta和M值的差别

  • M-values具有更好的统计特性，更适合用于进行下游的统计分析（差异分析等）
  • Beta-values更加容易解释，更能说明生物学上的意义

β值的具体意义

  • 任何等于或大于0.6的β值都被认为是完全甲基化的
  • 任何等于或小于0.2的β值被认为是完全未甲基化的
  • β值在0.2和0.6之间被认为是部分甲基化的

其它学徒作业目录如下：

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