跟着全网第一个单细胞视频课程和配套习题学是最佳策略

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这里不是要宣传课程，我再三强调你其实可以不需要购买视频了，除非你对我的声音有特殊的爱好，或者其他我不知道的原因，我们已经有了完整版文字教程以及配套GitHub代码啦！
而且，文末的习题非常重要！

文字版教程

第一单元：文献背景及课程介绍

  • （一）听说课程配笔记，学习无压力
  • （二）单细胞转录组学习笔记-2
  • （三）单细胞转录组上游分析之shell回顾
  • （四）获取Github代码包以及准备工作

    第二单元：常规转录组基础知识回顾

  • （五）常说的表达矩阵，那得到之后呢？
  • （六）由表达矩阵看内部异质性
  • （七）重复平均表达量和变异系数相关性散点图
  • （八）聚类算法之PCA与tSNE
  • （九）统计细胞检测的基因数量
  • （十）乳腺癌领域之PAM50分类
  • （十一）生物学背景知识之细胞周期推断
  • （十二）RPKM概念及计算方法
  • （十三）差异分析及KEGG注释简介

    第三单元：单细胞3大R包的学习

  • （十四）学习scRNAseq这个R包
  • （十五）利用scRNAseq包学习scater
  • （十六）用Scater包分析文章数据
  • （十七）用Seurat包分析文章数据（二）
  • （十八）scRNA包学习Monocle2
  • （十九）使用monocle2分析文章数据

    第四单元：重复文章图表

  • （二十）使用作者代码重复结果

    第五单元：结合公共数据库

  • （二十一）基因在任意癌症表达量相关性
  • （二十二）评估任意基因集在癌症的表现
  • （二十三）多个基因集相关性热图

    习题

    其中 1-10题是针对scRNAseq包的单细胞表达矩阵测试大家对单细胞转录组的理解，已经部分统计可视化基础知识。主要参考数据集的教程：study_scRNAseq.html ： http://bio-info-trainee.com/tmp/scRNA/study_scRNAseq.html
    第 11-20题是使用3大R包从细胞的降维和分群到每个群细胞的功能注释，最后到公共数据库的注释，生存分析看不同细胞亚群的临床意义。

    第一部分

    Q1: 在rstudio里面下载安装scRNAseq包

    注意切换镜像哦，留意一下你安装scRNAseq包的时候，附带安装了多少个其它依赖包！

    Q2: 找到scRNAseq包数据的文献

    注意文章其实是 301 cells (mixture of 11 different cell types) (Pollen et al., 2014)，但是scRNAseq包里面只有130个细胞，就4类，分别是 pluripotent stem cells 分化而成的 neural progenitor cells (“NPC”) ，还有 “GW16” and “GW21” ，“GW21+3” 这种孕期细胞。

    Q3: 加载scRNAseq包并且探索表型信息

    主要是找到文库大小那一列，因为这130个细胞数据的测序深度不一样，可以很明显区分成为两组

    Q4: 加载scRNAseq包并且探索表达矩阵

    有多少个基因在所有的130个细胞均不表达？多少个基因在所有细胞都表达呢？所有的细胞平均表达多少个基因呢？过滤表达矩阵，主要是剔除那些在所有细胞均不表达的基因。

    Q5: 对过滤后的表达矩阵取top1000的mad基因

    同时对top1000的sd，cv，mean和mad的基因做韦恩图

    Q6: 对top1000的mad基因表达矩阵进行相关性热图，hclust可视化，pca可视化

    注意这个时候的表达矩阵是1000个基因的130个细胞

    Q7: 对pca的前5个主成分矩阵进行tSNE

    这个时候是5个主成分的130个细胞的矩阵，所以tSNE运算很快！拿到tSNE的二维坐标并且可视化。

    Q8: 对tSNE的二维坐标进行kmeans或者dbscan算法聚类

    使用table函数比较kmeans或者dbscan算法聚类的区别，也可以跟细胞原始Biological_Condition比较。

    Q9: 把测序深度分组当做批次效应使用SVA包的combat函数去除

    自行搜索SVA包的combat函数用法，学会微信搜索

    Q10: 把测序深度分组当做批次效应使用scran包的MNN算法进行去除

    首先需要读https://mp.weixin.qq.com/s/i4_kzuAkNZYnB_DfwS-Ppg，了解多个单细胞转录组样本数据整合的来龙去脉，然后参考https://mp.weixin.qq.com/s/j5qKzR7LHVNp1v1wRAImQg ，使用scran包的MNN算法来去除多个单细胞转录组数据批次效应！
    如果你能学会我的这个rmarkdown报表格式的写作就最好了，加油！

    第二部分

    单细胞R包如过江之卿，这里只考核大家5个R包，分别是: scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop 需要熟练掌握它们的对象，：一些单细胞转录组R包的对象 而且分析流程也大同小异：

  • step1: 创建对象
  • step2: 质量控制
  • step3: 表达量的标准化和归一化
  • step4: 去除干扰因素(多个样本整合)
  • step5: 判断重要的基因
  • step6: 多种降维算法
  • step7: 可视化降维结果
  • step8: 多种聚类算法
  • step9: 聚类后找每个细胞亚群的标志基因
  • step10: 继续分类

    Q11: 使用scater或者scran包对scRNAseq包内置的表达矩阵和临床信息创建对象

    注意这两个R包都是SingleCellExperiment函数，这个 SingleCellExperiment 对象，被很多单细胞R包采用。

    Q12: 使用monocle,Seurat,M3Drop同样的创建对象

    注意，这3个R包创建对象的函数各不相同，其中Seurat还有V2，V3版本的差异。

    Q13:对scRNAseq包内置的表达矩阵根据基因或者细胞进行过滤

    提示，如果被R包（scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop ）包装后的过滤，需要考虑对象问题，不同R包的函数不一样，比如：

    sce@raw.data
GetAssayData()
calculateQCMetrics(),其中的feature_controls参数可以指定过滤指标，然后有一系列的可视化函数。过滤用filter()或isOutlier()
用基础R函数进行初步过滤，还可以用detectGenes()函数加上subset()过滤
用基础R函数进行初步过滤

    Q14: 对scRNAseq包内置的表达矩阵寻找重要的基因

    如果是表达矩阵本身基因判断重要性，可以使用简单统计量，比如 MAD,SD,MEAN,CV等等，也可以使用复杂的公式(PS: 关于这个寻找重要的基因，我还写过：比较5种scRNA鉴定HVGs方法 )
    提示，如果被R包（scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop ）包装后的需要考虑对象问题，不同R包的函数不一样，比如：

    FindVariableGenes()
FindVariableFeatures()，其中算法有变动
没有专门函数
differentialGeneTest()函数
monocle版本3和版本2的差异分析可以说是完全不同，版本3取代了2中的differentialGeneTest() and BEAM()。它利用fit_models()或graph_test()

    Q15:对scRNAseq包内置的表达矩阵进行降维

    这里只需要数量找我PCA和tSNE即可，基础包可以做，如果被R包（scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop ）包装后的需要考虑对象问题，不同R包的函数不一样，比如：

    PCA：RunPCA()，参数pc.genes，结果存储在sce@dr
PCA：RunPCA()，参数features，结果存储在sce@reductionspca@gene.loadingstSNE：RunTSNE()∣PCA：RunPCA()，参数features，结果存储在sce@reductionspca@feature.loadings tSNE：RunTSNE()
PCA：runPCA()，结果在reducedDims中； tSNE：runTSNE()
reduceDimension函数，可以选择多种参数
reduce_dimension()，算法包括UMAP", "tSNE", "PCA" and "LSI"

    这个时候需要仔细思考，R包作者的创作思路。

    Q16: 降维后的细胞聚类

    注意切换镜像哦，基础包可以做，比如对tSNE的二维坐标进行kmeans或者dbscan算法聚类，但是如果被R包（scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop ）包装后的需要考虑对象问题，不同R包的函数不一样，比如：

    FindClusters()
FindNeighbors() + FindClusters()
没有包装聚类函数，可以辅助其它R包，或者R基础函数
clusterCells()
cluster_cells()，依赖一个Python模块louvain

    Q17: 细胞分群后找marker基因

    基础包可以做，主要是传统bulk转录组的差异分析思路，但是如果被R包（scater,monocle,Seurat,scran,M3Drop ）包装后的需要考虑对象问题，不同R包的函数不一样，比如：

    FindMarkers()或FindAllMarkers()
FindMarkers()或FindAllMarkers()，VlnPlot()、FeaturePlot()可视化
借助SC3包
newCellTypeHierarchy()、 classifyCells()
top_markers()

    Q18: 2017年NC的乳腺癌

    下载发表在 Nat Commun. 2017 May 的文献， 耗时一年才发表，算是乳腺癌领域非常早的单细胞转录组研究了。韩国人做的，题目是：Single-cell RNA-seq enables comprehensive tumour and immune cell profiling in primary breast cancer. 找到单细胞转录组表达矩阵 ：GSE75688 下载表达矩阵和样本信息，从GSE75688_GEO_processed_Breast_Cancer_raw_TPM_matrix.txt.gz文件里面仅仅是提取非tumor的细胞，使用SingleCellExperiment函数构建 SingleCellExperiment 对象后走scater的PCA并且可视化，看看表型文件GSE75688_final_sample_information.txt.gz记录的细胞类型是否区分的很开。

    Q19: 2016年4月science杂志的黑色素瘤

    下载发表在Science. 2016 Apr，题目是: Dissecting the multicellular ecosystem of metastatic melanoma by single-cell RNA-seq 文献，找到单细胞转录组表达矩阵 GSE72056， 研究者选择了 19个黑色素瘤病人，获得了4645个单细胞，进行转录组测序。文件是 GSE72056_melanoma_single_cell_revised_v2.txt.gz，载入R里面走scater流程即可。

    Q20: 2017年12月CELL杂志的头颈癌

    下载发表于2017年12月，在CELL杂志：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 的文献，找到单细胞转录组表达矩阵，数据公布在 GSE103322 。 研究者用Smart-seq2建库方法得到的单细胞转录组数据经过QC后，留下了来自18名患者的5,902个细胞，首先可以分成2215个恶性细胞和3363个非恶性细胞。 文件是 GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz，有86.0 Mb，对进行3363个非恶性细胞表达矩阵分群，根据已知标记基因（自行搜索）的表达，注释并且找到B细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，成纤维细胞和肌细胞这8类！

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