本文的重点在于讲解如何查看自己的peaks是否是正确的！我是直接用比对的bam文件来用samtools depth命令来获取peaks区域的测序深度，从而画图的，代码见step5-peaks-view-samtools-depth.R

在终端调用我的代码画图命令如下；

Rscript ~/scripts/peakView.R ../unique_peaks.bed ../../SRR2774675.unique.sorted.bam ../../SRR2774676.unique.sorted.bam
Rscript ~/scripts/peakView.R ../unique_peaks.bed ../../SRR2774675.unique.sorted.bam ../../SRR2774676.unique.sorted.bam

下面随便看两个peaks，很明显是双峰模型，而且IP的测序深度远高于INPUT，数据非常棒！

然后我不得不指出如果CHIP-seq实验失败，那么peaks会很诡异，首先你会看到测序深度大多都在10以下，即使有部分测序深度很高的，也是IP和INPUT的测序深度压根就没有差异，下面就是一个典型的失败案例！

这种实验失败的数据，实在是无法分析。而转录因子的CHIP-seq实验失败率还挺高的，所以一定要有control，否则再怎么分析也是 rubbish in rubbish out

nohup wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByExp/sra/SRX/SRX182/SRX182682/SRR553473/SRR553473.sra &

nohup wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByExp/sra/SRX/SRX182/SRX182683/SRR553474/SRR553474.sra &

nohup wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByExp/sra/SRX/SRX182/SRX182684/SRR553475/SRR553475.sra &

ls *sra |while read id; do ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump $id;done

rm *sra

ls *.fastq | while read id ; do ~/biosoft/fastqc/FastQC/fastqc $id;done

### 36 bp   45 GC%

## cat >runBowtie2.sh

ls *.fastq | while read id ;

do

echo $id

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 8 -x ~/biosoft/bowtie/hg19_index/hg19 -U $id   -S ${id%%.*}.sam  2>${id%%.*}.align.log;

samtools view -bhS -q 30  ${id%%.*}.sam > ${id%%.*}.bam

#  -F 1548 https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html

#  -F 0x4  remove the reads that didn't match

samtools sort   ${id%%.*}.bam ${id%%.*}.sorted  ## prefix for the output

#samtools view  -bhS     a.sam | samtools sort -o  -  ./ > a.bam

samtools index ${id%%.*}.sorted.bam

done

nohup time ~/.local/bin/macs2 callpeak 　-t SRR553473.sorted.bam -f BAM -g hs -n BRCA1    2>BRCA1.masc2.log &

nohup time ~/.local/bin/macs2 callpeak 　-t SRR553474.sorted.bam -f BAM -g hs -n PALB2    2>PALB2.masc2.log &

nohup time ~/.local/bin/macs2 callpeak 　-t SRR553475.sorted.bam -f BAM -g hs -n P_Ser2    2>P_Ser2.masc2.log &

nohup samtools depth SRR553473.sorted.bam | perl -ne 'BEGIN{ print "track type=print wiggle_0 name=SRR553473 description=SRR553473\n"}; ($c, $start, $depth) = split; if ($c ne $lastC) { print "variableStep chrom=$c span=10\n"; };$lastC=$c; next unless $. % 10 ==0;print "$start\t$depth\n" unless $depth<3' > SRR553473.wig    &

nohup samtools depth SRR553474.sorted.bam | perl -ne 'BEGIN{ print "track type=print wiggle_0 name=SRR553474 description=SRR553474\n"}; ($c, $start, $depth) = split; if ($c ne $lastC) { print "variableStep chrom=$c span=10\n"; };$lastC=$c; next unless $. % 10 ==0;print "$start\t$depth\n" unless $depth<3' > SRR553474.wig    &

nohup samtools depth SRR553475.sorted.bam | perl -ne 'BEGIN{ print "track type=print wiggle_0 name=SRR553475 description=SRR553475\n"}; ($c, $start, $depth) = split; if ($c ne $lastC) { print "variableStep chrom=$c span=10\n"; };$lastC=$c; next unless $. % 10 ==0;print "$start\t$depth\n" unless $depth<3' > SRR553475.wig    &

## cat >xls2bed.sh

ls *.xls | while read id ;

do

echo $id

grep '^chr\S' $id |perl -alne '{print "$F[0]\t$F[1]\t$F[2]\t$F[9]\t$F[7]\t+"}' >${id%%.*}.bed

done

bash xls2bed.sh

cd ~/CHIPseq_test/annotation

nohup ~/.local/bin/ceas --name=BRCA1_ceas --pf-res=20 --gn-group-names='Top 10%,Bottom 10%'  -g hg19.refGene \

-b ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/BRCA12_peaks.bed -w  ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/SRR553473.wig  2>BRCA1.ceas.log &

nohup ~/.local/bin/ceas --name=PALB2_ceas --pf-res=20 --gn-group-names='Top 10%,Bottom 10%'  -g hg19.refGene \

-b ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/PALB22_peaks.bed -w  ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/SRR553474.wig  2>PALB2.ceas.log &

nohup ~/.local/bin/ceas --name=P_Ser2_ceas --pf-res=20 --gn-group-names='Top 10%,Bottom 10%'  -g hg19.refGene \

-b ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/P_Ser22_peaks.bed -w  ~/CHIPseq_test/BRAC1-PALB2/raw/SRR553475.wig  2>P_Ser2.ceas.log &

cd ~/CHIPseq_test/

mkdir GSE20042_H3K4me2_3 && cd GSE20042_H3K4me2_3

mkdir rawData && cd rawData

for ((i=146;i<153;i++)) ;do wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP002/SRP002077/SRR037$i/SRR037$i.sra;done

ls *sra |while read id; do ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump $id;done

rm *sra

ls *.fastq | while read id ; do ~/biosoft/fastqc/FastQC/fastqc $id;done

mkdir QC_results

mv *zip *html QC_results/

##接下来做比对

## cat >run_bowtie2.sh  运行这个脚本批量做alignment

ls *.fastq | while read id ;

do

echo $id

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -3 5 -p 8 -x ~/biosoft/bowtie/hg19_index/hg19 -U $id   -S ${id%%.*}.sam  2>${id%%.*}.align.log;

samtools view -bhS -q 30  ${id%%.*}.sam > ${id%%.*}.bam  ## -F 1548 https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html

samtools sort   ${id%%.*}.bam ${id%%.*}.sorted  ## prefix for the output

samtools index ${id%%.*}.sorted.bam

done

tar xvf GSE20042_RAW.tar

ls *gz |xargs gunzip

wc -l *txt

  235639 GSM503903_LNCaP_H3K4me2_Vehicle_2Lanes_normalized_peak.txt

  248570 GSM503904_LNCaP_H3K4me2_DHT_4h_2Lanes_normalized_peak.txt

  185892 GSM503905_LNCaP_H3K4me2_DHT_16h_peak.txt

   74491 GSM503906_LNCaP_H3K4me3_Vehicle_normalized_peak.txt

  104022 GSM503907_LNCaP_H3K4me3_DHT_4h_normalized_peak.txt

最常用的是 meme工具套件 ：

 http://meme-suite.org/  输入文件是fasta序列，需要对peaks进行转换，根据bed的基因坐标从基因组里面提取对应的序列咯： http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/getfasta.html

它里面集成了4个寻找motif 的工具，每个工具都是一篇文章，里面有详细描述具体原理，但是整个网页给人的感觉是too busy，让初学者无从下手。

如果是对MACS找到的peaks记录文件，还需提取对应的列给HOMER作为输入文件：