rm(list=ls())

searchGene = 'TP53';

searchTable='tumor_brca_rpkm';

library(RMySQL)

con <- dbConnect(MySQL(), host="127.0.0.1", port=3306, user="root", password="11111111")

dbSendQuery(con, "USE gse62944")

dbListTables(con)

query = paste0(' select * from ', searchTable ,' where genesymbol = ',shQuote(searchGene)) ;

expression_1=dbGetQuery(con,query)

expression_1=as.numeric(expression_1[,-1]);

query = paste0(' select geneSymbol from ', searchTable ) ;

allGenes=dbGetQuery(con,query)[,1]

## 重点就是获取这个数据，然后计算相关系数和p值

## 这个非常慢，可以考虑加并行，并且显示进度条，当然，这种循环所有的基因我不推荐用mysql来做！！！

cor_results <- matrix(unlist(lapply(allGenes, function(x){

  thisGene=x

  query = paste0(' select * from ', searchTable ,' where genesymbol = ',shQuote(thisGene)) ;

  expression_2=dbGetQuery(con,query)

  expression_2=as.numeric(expression_2[,-1]);

  tmp=cor.test(expression_1,expression_2);#str(tmp)

  return(c(thisGene,tmp$estimate,tmp$p.value))

}) ## end for lapply

) ## end for unlist

,ncol = 3, byrow =T) ## end for matrix

library(RMySQL)
con <- dbConnect(MySQL(), host="127.0.0.1", port=3306, user="root", password="11111111")
dbSendQuery(con, "USE gse62944")
dbListTables(con)
setwd('G:\\GSE62944') ## 这里不需要读本地文件，可以修改为读取数据库内容，因为我们第一讲说明了如何把它们全部load到数据库里面
tumorCancerType2amples=read.table('GSE62944_06_01_15_TCGA_24_CancerType_Samples.txt',sep = '\t',stringsAsFactors = F)
colnames(tumorCancerType2amples)=c('sampleID','CancerType')
## 不同的cancer type是分表存储，所以需要多次查询这两个基因的表达量
tmp=lapply(unique(tumorCancerType2amples$CancerType), function(x){
#x='PRAD'; ##可以先不要运行循环，先测试一个癌种
gene1="TP53";gene2="BRCA1";
sqlTable=paste('tumor',x,'RPKM',sep='_')
sqlQuery=paste0(' select * from ', sqlTable ,' where genesymbol = ',shQuote(gene1),' OR genesymbol = ',shQuote(gene2))
matrix2genes=dbGetQuery(con,sqlQuery)
rownames(matrix2genes)=matrix2genes$geneSymbol
matrix2genes=matrix2genes[,- match('geneSymbol',colnames(matrix2genes)) ]
matrix2genes=t(matrix2genes)
valueList1=as.numeric(matrix2genes[,gene1]);valueList2=as.numeric(matrix2genes[,gene2]);
png( paste0(gene1,'_and_',gene2,'_in_',x,'.SinalCor.png') )
plot(valueList1,valueList2,xlab=gene1,ylab=gene2)
abline(lm(valueList2~valueList1),col='red')
title(main =paste0("R2=",cor(valueList1,valueList2)))
dev.off()
return(c(x,fivenum(valueList1),fivenum(valueList2),cor(valueList1,valueList2)))
})

## 这个循环会对每一个癌种种类，都画这两个基因的correlation图
write.csv(x = matrix(unlist(tmp),ncol=12,byrow = T),file = 'tumor.corration.csv')

 

如果是对正常样本查询，因我TCGA的正常样本不多，所以我存储在同一个表，不需要这样循环查询每一个癌种表格，所以拿到数据非常简单，代码大家可以试试看！

代码如下：

稍微懂一点R的小伙伴都看得出来，只需要手动修改指定的基因，然后指定的癌症种类，就可以来容易画上面的图了，但要完成这一步，必须把前面的那一步导入mysql数据库搞懂。

TCGA表达数据的多项应用之1–下载数据并且导入mysql

rm(list=ls())

searchGene = 'VCX3B';

searchTable1='tumor_gbm_rpkm';

searchTable2='tumor_lgg_rpkm';

library(RMySQL)

con <- dbConnect(MySQL(), host="127.0.0.1", port=3306, user="root", password="11111111")

dbSendQuery(con, "USE gse62944")

dbListTables(con)

query = paste0(' select * from ', searchTable1 ,' where genesymbol = ',shQuote(searchGene)) ;

gbm=dbGetQuery(con,query)

query = paste0(' select * from ', searchTable2 ,' where genesymbol = ',shQuote(searchGene)) ;

lgg=dbGetQuery(con,query)

gbm=as.numeric(gbm[,-1]);gbm=data.frame(value=gbm,type='gbm')

lgg=as.numeric(lgg[,-1]);lgg=data.frame(value=lgg,type='lgg')

dat1= rbind(gbm,lgg)

boxplot( value ~  type, data = dat1, lwd = 2, ylab = 'value')

stripchart(value ~ type, vertical = TRUE, data = dat1,

           method = "jitter", add = TRUE, pch = 20, col = 'blue')

还有他们的临床信息，也结合起来分析，具体样本个数，以及癌症种类分布见下表。

 六种数据分别是：

全外显子组的somatic突变数据，

affymetrix的snp6.0芯片的拷贝数变异数据，

人甲基化450K芯片的DNA甲基化数据，

RNA-seq的mRNA表达量数据，

miRNA的表达量数据，

蛋白表达数据。

文章对这些数据做了6个方面的分析：

一是对各个样本进行权重矫正

这个偏统计学了，大家可以自己去看原理，主要是为了排除除性别外的其它影响因素( sex, age at diagnosis, smoking status, tumor stage, and histology subtype),采用了一种叫做propensity score.的统计学方法来矫正这些共影响因子，这一统计方法是上世纪80年代提出了的，被广泛应用于clinical research, economics, and social sciences。

二是用六种数据结合起来把癌症根据性别影响分成两类

三是单独拿somatic mutation数据来分析

然后作者把这张图描述了一些生物学意义，比如某些癌种某些基因的男女患者差异非常显著，该基因功能是什么，可能的原因是什么，等等。

四是单独拿somatic的CNV数据来分析

这个分析也很简单，还是直接从Firehose (http://gdac.broadinstitute.org) 里面下载了所有的上面列出的样本的CNV数据，然后每个癌种都分男女分别跑一下GISTIC这个软件，得到somatic的拷贝数变异数据库，GISTIC软件是基于matlab的，在我的博客有详细介绍该软件如何使用。

把GISTIC的结果，包括focal and arm-level amplifications/deletions都进行了信息的生物学解释，哪些基因很重要，哪些通路很重要，都详细的描述了，这个需要作者具有渊博的生物学背景知识，而不是数据分析技巧了。

五是结合4种表达量数据来分析

六是根据自己的分组来探索一些临床指标以及药物可能的影响。

这个算是本文比较新颖的地方了，作者从FDA批准的一些癌症相关药物里面找到了这些药物作用的基因，然后把这些基因跟有性别差异的基因进行交叉比较。

这个研究意义非凡，因为现在对癌症病人用药都是一视同仁，不会考虑到性别的差异，而我们的分析恰恰证明了癌症患者的性别差异还是蛮大的，为了更好的治疗，这些必须考虑进去。比如SRC这个基因在HNSC这个癌症患者里面，女性比男性显著高表达。

下面这个高大上的图说明了一切，但想真搞明白，不是一天两天的事情。

而分析结果里面，最有用的就是somatic mutation了，我前面很多博客都提到过somatic mutation，包括它的概念以及分析流程，但是我们还有更方便的办法，直接下载已经分析好的somatic mutation文件！

至少目前所有TCGA的somatic mutation文件都是可以下载的：https://wiki.nci.nih.gov/display/TCGA/TCGA+MAF+Files

研究了4,938,362 mutations from 7,042 cancers样本，突变频谱的概念只是针对于somatic 的mutation。一般是对癌症病人的肿瘤组织和癌旁组织配对测序，过滤得到的somatic mutation，一般一个样本也就几百个somatic 的mutation。

paper链接是：http://www.nature.com/nature/journal/v500/n7463/full/nature12477.html

从2013年提出到现在，已经有30种mutation siganures，在cosmic数据库有详细记录，更新见：http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/signatures

它的概念就是：根据突变上下文分成96类，然后每类突变的频率不一样画一个条形图，可视化展现。

Each signature is displayed according to the 96 substitution classification defined by the substitution class and sequence context immediately 3′ and 5′ to the mutated base. The probability bars for the six types of substitutions are displayed in different colours.

仔细看paper，还是蛮好理解的，自己写一个脚本就可以做这个分析了，前提是下载各个癌症的somatic mutation文件，一般是maf格式的，很多途径下载。

In principle, all classes of mutation (such as substitutions, indels, rearrangements) and any accessory mutation characteristic, for example, the sequence context of the mutation or the transcriptional strand on which it occurs, can be incorporated into the set of features by which a mutational signature is defined. In the first instance, we extracted mutational signatures using base substitutions and additionally included information on the sequence context of each mutation. Because there are six classes of base substitution—C>A, C>G, C>T, T>A, T>C, T>G (all substitutions are referred to by the pyrimidine of the mutated Watson–Crick base pair)—and as we incorporated information on the bases immediately 5′ and 3′ to each mutated base, there are 96 possible mutations in this classification. This 96 substitution classification is particularly useful for distinguishing mutational signatures that cause the same substitutions but in different sequence contexts.

很多癌症都发现了不止一种mutation signature，甚至高达6种，说明癌症之间差异还是蛮大的！

In most cancer classes at least two mutational signatures were observed, with a maximum of six in cancers of the liver, uterus and stomach. Although these differences may, in part, be attributable to differences in the power to extract signatures, it seems likely that some cancers have a more complex repertoire of mutational processes than others.

Most individual cancer genomes exhibit more than one mutational signature and many different combinations of signatures were observed

但是，我最后也没能绝对的界限是什么，因为总不能用肉眼来看每个突变频谱不一样吧？

The set of signatures will be updated in the future. This will include incorporating additional mutation types (e.g., indels, structural rearrangements, and localized hypermutation such as kataegis) and cancer samples. With more cancer genome sequences and the additional statistical power this will bring, new signatures may be found, the profiles of current signatures may be further refined, signatures may split into component signatures and signatures may be found in cancer types in which they are currently not detected.

分类会持续不断更新，随着更多的cancer type和样本加入，新的signature会被发现，现有的signature也可能会被重新定义，或者被分割成多个小的signature

用my.surv <- surv(OS_MONTHS,OS_STATUS=='DECEASED')构建生存曲线。

用kmfit2 <- survfit(my.surv~TUMOR_STAGE_2009)来做某一个因子的KM生存曲线。用 survdiff(my.surv~type, data=dat)来看看这个因子的不同水平是否有显著差异，其中默认用是的logrank test 方法。

用coxph(Surv(time, status) ~ ph.ecog + tt(age), data=lung) 来检测自己感兴趣的因子是否受其它因子(age,gender等等)的影响。