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转录组 de novo流程–包括转录本完整注释

ulwvfje — Tue, 12 Jul 2016 12:03:39 +0000

有网友咨询过对于没有参考基因组或者转录组的物种，如何做RNA-seq分析。我觉得这个问题太大了，而且我还真的对这个没有经验。但是我以前看到过一篇文献，里面提到过一个非常全面的转录组 de novo组装注释流程，所以我摘抄了文章里面的生物信息学处理部分，分享给大家：

文章是RNA-seq analysis for plant carnivory gene discovery in Nepenthes × ventrata马来西亚的学者的研究，

文章非常短小，吓了我一跳~

期刊名 FRONTIERS IN PLANT SCIENCE 出版周期：不详. 常用链接 ... SCI(2014)：3.948 感觉这个杂志影响因子还会继续升

实验设计流程一模一样，发了两篇paper

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4707257/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4778577/

测序策略都是 Illumina HiSeq 2500 sequencing platform. Paired end reads of 125 bp

数据处理流程：

Trimmomatic --》 Trinity (v2.0.6) --》 Transdecoder --》Trinotate (v2.0.0)

这些软件我博客都有使用记录

下面是技术详情：

Raw reads from all three data sets were filtered to remove adapter sequences with sequence pre-processing tool, Trimmomatic [2]. High quality Illumina raw reads with phred score ≥ 25 were kept for assembly. De novo assembly of these processed reads was performed with Trinity (v2.0.6) [3]. Statistics of the assembly is showed in Table 1.

Protein coding sequences of unique transcripts were analyzed via Transdecoder version v2.0.1 as a part of Trinity analysis pipeline. Standard Trinotate (v2.0.0) annotation pipeline (https://trinotate.github.io/) was carried out to annotate the assembled unique transcripts against Swissprot [4], Pfam [5], eggNOG [6], Gene Ontology [7], SignalP [8], and Rnammer [9]. Summary of the annotation is showed in Table 2.

所以重点是学会以下几个软件：

Trinotate http://trinotate.github.io download Trinotate
Trinity (includes support for expression and DE analysis using RSEM and Bioconductor): http://trinityrnaseq.github.io/ download Trinity. >Note, Trinity is not absolutely required. It is possible to use Trinotate with other sources of transcript data as long as suitable inputs are available.
TransDecoder for predicting coding regions in transcripts http://transdecoder.github.io download TransDecoder.
sqlite (required for database integration): http://www.sqlite.org/
NCBI BLAST+: Blast database Homology Search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK52640/
HMMER/PFAM Protein Domain Identification: http://hmmer.janelia.org/download.html

数据都是可以下载的，也比较适合大家练手：

Transcriptome profile of N. × ventrata were generated from the polyA-enriched cDNA libraries prepared from total RNA extracted from its pitcher. The short reads were filtered, processed, assembled and analyzed as describe in the next section. Raw data for this project were deposited at SRA database with the accession numbers SRX1389337 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1389337) for day 0 control, SRX1389392 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1389392) for day 3 longevity experiment, and SRX1389395 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1389395) for day 3 chitin-treatment experiment.

Transcriptome profile of N. ampullaria was generated from the polyA-enriched cDNA libraries prepared from total RNA extracted from its pitcher. The short reads were filtered, processed, assembled, and analyzed as described in the next section. Raw data for this project were deposited at SRA database with the accession numbers SRX1400303 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1400303) for day 0 control, SRX1400308 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1400308) for day 3 longevity experiment, and SRX1400311 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX1400311) for day 3 fluid protein depletion experiment. Assembled transcriptome fasta sequences can be accessed at http://gohlab.researchfrontier.org/public-datasets/Nepenthes-ampullaria-Trinity-gohlab.fasta.

转录组-TransDecoder-对trinity结果进行注释

ulwvfje — Thu, 19 Mar 2015 12:38:33 +0000

一：下载安装该软件

下载安装该软件： wget https://codeload.github.com/TransDecoder/TransDecoder/tar.gz/2.0.1

解压进入该目录，查看里面的文件

make一下就可以用了，看起来好像是依赖于perl模块的

这个TransDecoder.LongOrfs就是我们这次需要的程序，查看该程序，的确真是一个perl程序，看来perl还是蛮有用的。

二：准备数据

它里面有个测试数据，是比较全面的，也比较复杂，我就不贴出来了，反正我是那trinity组装好的fasta格式的转录组数据来预测ORF的。

三：运行命令

它给的测试命令也很复杂

## generate alignment gff3 formatted output

../util/cufflinks_gtf_to_alignment_gff3.pl transcripts.gtf > transcripts.gff3

## generate transcripts fasta file

../util/cufflinks_gtf_genome_to_cdna_fasta.pl transcripts.gtf test.genome.fasta > transcripts.fasta

## Extract the long ORFs

../TransDecoder.LongOrfs -t transcripts.fasta

当然我们只需要看最后一步，这是重点

我这里是直接对我们的trinity组装好的转录本进行预测ORF

/home/jmzeng/bio-soft/TransDecoder/TransDecoder.LongOrfs -t Trinity.fasta

命令很简单

输出来的文件就有预测的蛋白文件，这个文件是trinotate对转录本进行注释所必须的文件

四：输出文件解读

longest_orfs.cds 这个是预测到的cds碱基序列，

longest_orfs.gff3 这个是预测得到的gff文件

longest_orfs.pep 这个就是预测得到的蛋白文件

Trinity进行转录组组装的使用说明

ulwvfje — Thu, 12 Mar 2015 12:56:58 +0000

Trinity进行转录组组装的使用说明

一：下载安装该软件

去官网下载trinity并解压安装 http://trinityrnaseq.github.io/

安装非常简单，一个make即可

这个软件比较大，约150M。所以安装需要一会时间，以下是安装进程日志，可以看出trinity这个软件安装的同时还附带着好几个测序一起安装进来了。

安装之后即可使用啦，就在安装目录下那个绿色的就是可执行文件，可以添加到环境变量直接调用，也可以用全路径来调用。

二：准备数据

它的功能就是来组装转录组的，所以需要的就是转录组的测序reads序列fastq格式即可

三：运行命令

查看help

可以看到其实简单的使用trinity是非常简单的，只需要三个参数即可

/home/jmzeng/bio-soft/trnity/Trinity --seqType fq --single SRR1793917.fastq --CPU 16 --max_memory 50G

然后就可以精心等待结果啦

等了一晚上没看到结束，我top了一下，看到了一大堆的进程

包括了trinity的第三方插件，它的perl程序包，它的另外两个套件butterfly和chrysalis

还调用了工具包里面的一下java程序

我进去后台看了程序，第一个阶段已经完成啦，

然后是第二个阶段的工作，正在进行中，第二个工作是由parafly来完成的

又等了一个白天，终于跑完了

耗时约25个小时，但是我看不懂总共时间显示。

四：输出文件解读

总共产出的文件特别多

其中Trinity.fasta是最重要的，是整个软件组装好的RNA数据

共178100条转录本

搜索学习其他学者的RNA数据处理流程（包括原始数据、脚本、中间文件）

ulwvfje — Sat, 07 Mar 2015 11:52:20 +0000

搜索其他学者的RNA数据处理流程（包括原始数据、脚本、中间文件）

一：原始数据

是谷歌里面无意中搜索到的，是某个物种的RNA数据，不是很大，但是里面有所有的分析流程，非常方便，对原始reads进行了组装，和注释。

http://moana.dnsalias.org/~sgeib/Anth_RNAseq/Run2.1/RawData/

打开网址可以看到raw data的下载链接

二：中间文件

可以清楚的看到所有的流程操作手册

要是有空，可以对它们做一次检验，需要的空间不大40多个G的空间即可。

它是通过solexaQA套件中的两个perl程序来过滤reads的

它过滤之前和过滤之后都用来fastqc来进行质控画图

过滤之后的数据量如图所示

对这些reads进行trinity组装好得到转录本信息，是312M的数据量

转录本的统计信息如下

三：处理流程

四：所有的脚本，有兴趣的同学可以自行下载慢慢解读