MicroRNA Regulation of Cbx7 Mediates a Switch of Polycomb Orthologs during ESC Differentiation

这篇文章就是做了CBX7的perturbation实验。

The Polycomb Group (PcG) of chromatin modifiers regulates pluripotency and differentiation.

PRC1 很复杂，Cbx (Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, or Cbx8); Ring1A or Ring1B; PHC (PHC1, PHC2, or PHC3); PCGF (PCGF1, PCGF2, PCGF3, PCGF4, PCGF5, or PCGF6); and RYBP or YAF2

就是 Polycomb (Pc), Posterior sex combs (Psc), Polyhomeotic (Ph), and Sex combs extra (Sce) proteins ，在哺乳动物里面有five Pc, six Psc, three Ph, and two Sce orthologs

而在ESC里面，起主要作用的是CBX7。如果ESC细胞开始分化，那么CBX7会下降，而受它抑制的Cbx2, Cbx4, and Cbx8会上升。

外源过表达CBX7，或者抑制它，会抑制或者促进ESC的分化。

PRC2 的EZH2会催化H3K27me3 ，而PRC1的一个组分(cbx7)可以读取(识别)H3K27me3 从而被招募过来，行使H2AK119ub的功能。

pluripotency network相关的TFs有Sox2, Oct4, and Nanog，对5个Pc来说，它们的唯一target是CBX7，作者用了两套siRNAs 系统来knocked down Cbx7，并且经过了qRT-PCR 验证，发现ESC细胞系开始分化，无法维持全能性。而这样的表型与knocked down 那些pluripotency network相关的TFs有Sox2, Oct4, and Nanog的类似的。

为了防止是siRNA的off-target 效应，作者还做了shRNA (pLKO-shCbx7.1) that targets the 3′UTR of Cbx7 实验来验证。

同理作者也做了ESCs overexpressing Cbx7实验，强烈抑制了X chromosome inactivation现象。

作者猜测是miRNA在调控CBX7，所以设计了mouse Cbx7-3′UTR reporter (psiCHECK2-Cbx7-3′UTR) 跟371个已知的miRNA文库做筛查实验，设定阈值挑选到 miR-125 和 miR-181 。所以设计了这两个miRNA的质粒载体来做实验验证。

Nonoverlapping Functions of the Polycomb Group Cbx Family of Proteins in Embryonic Stem Cells

观点就是：Maintenance of pluripotency primarily depends on Cbx7, while lineage commitment is orchestrated by Cbx2 and Cbx4.

以前认为PRC2 and PRC1共同且统一的增加H3K27me3 and H2AK119Ub1使得转录更加抑制。

作者做了Ring1B (PRC1), Suz12 (PRC2)还有H3K27me3, H3K4me3, and H3K36me3这些ChIP-seq数据，并且都分析出来了它们各自的target genes

We identified 2,349 Cbx7 target genes, of which 96.7% were co-occupied by Ring1B(说明Ring1B and Cbx7的调控基因大量共享)

We found an overlap of 96.9% between Cbx7 and Suz12 target genes, of which 85.6% were also decorated with H3K27me3

然后是这些peaks的各种overlap情况说明，分别是哪些gene list，这些gene list的GO/KEGG分析结果如何。

然后是细胞学实验，a control and two stable Cbx7 knockdown ESC lines (shRNA-CTR, shRNA-Cbx7#31, and shRNA-Cbx7#33) 这3个细胞系，并且用芯片做了表达测量。

A comparative gene expression profile between control and Cbx7-depleted ESCs revealed altered expression of 1,886 genes, of which 833 were upregulated and 1,053 were downregulated

同时把这些上调下调基因跟上面的各种ChIP-seq数据得到的target genes做overlap分析。

Ring1B 结合的基因高达16,028个， 说明它有着广泛调控作用。这些基因并不都会结合Cbx2 or Cbx4.但是96.4% of Cbx4 (7,160) and 99% of Cbx2 (1,400)都会结合Ring1B

RYBP-PRC1 Complexes Mediate H2A Ubiquitylation at Polycomb Target Sites Independently of PRC2 and H3K27me3

以前通常认为，PRC2催化形成的H3K27me3可以招募PRC1到核小体上面，从而发挥H2AK119Ub1作用，但是PRC1/H2AK119u1的目标基因跟H3K27me3并非完全重合。

作者在PRC2-deficient mouse ESCs里面发现PRC1仍然可以被激活，原来是RYBP-PRC1，而还参与 Xist RNA-mediated silencing！

首先得到并证明 PRC2 null mESCs， H3K27me3 was depleted in Eed−/−mESCs。虽然PRC1的核心组分RING1B/MEL-18也减少了，但还有残留。而且H2AK119u1水平几乎不改变！

然后还设计conditional knockout (cKO) Eed−/− ESC line，用doxycycline 处理细胞系15天，不改变mESCs的全能性，WB结果表明EED全部去除了，也检测不到H3K27me3 现象。PRC2的另外两个核心组分(EZH2 and SUZ12 )也显著下降。但是H2AK119u1 和RING1B 几乎木有改变！

所以作者做了 RING1B ChIP-sequencing (ChIP-seq) in Eed+/+ and Eed−/− ESCs.

重点研究了Irx2, Msx1,HoxD 这些典型的PcG targets in mESCs  ，还有 Oct3/4(有表达)，Gata1(沉默)这样的典型的Non-PcG target loci。那么敲除EED前后的RING1B的peaks文件就需要详细解释。用的是MACS软件，前者有2,347 个peaks，后者有1,810 个！它们实际上非常类似。this pattern can be observed when comparing to input sample but is not recognized as a peak due to increased background relative to signal.

同样的，对这些gene list做了GO/KEGG分析，而还跟CpG islands做了比较。

总之说明了，EED对RING1B影响不大

MG132 是一个 reversible proteasome inhibitor(可逆性蛋白酶体抑制剂) 可以针对性的去除H2AK119u1 ，因为我们怀疑虽然PRC2催化形成的H3K27me3可以招募PRC1到核小体，但是一旦招募上了PRC1，形成了H2AK119u1 ，它就可以形成正反馈自己招募自己，持续增强！结果表明这个猜想是对的！

因为RING1B也不能完全代表PRC1， Because RING1B associates with non-PRC1 complexes，有人认为，MEL-18(PGRF2)是 core PRC1 protein , 还有一个是BMI1，就是PGRF4。所以作者设计了一个非常复杂的实验系统，LC-MS/MS(liquid chromatography-tandem mass spectrometry) 涵盖了 PRC1所有组分，说明了RYBP 的可以招募PRC1重要性。而且在其它细胞系neural stem cells (NSCs)做了实验，说明RYBP with MEL-18的相互作用不是细胞特异性的。

当然RYBP 也不能完全代表PRC1，它还参与E2F6 和BCOR 复合物。RYBP and CBX 蛋白都结合在RING1B 同样的表面，所以它们是互斥的。

接着作者做了 ChIP analysis for RYBP in Eed4 WT and Eed4 cKO mESCs 发现RYBP 的结合并没有被显著改变。而且加入MG132的处理，也是类似的结果，所以说明并不是PRC2催化H3K27me3从而招募PRC1催化形成H2AK119u1 来招募RYBP 。

接着又做了 ChIP-seq analysis of RYBP and CBX7 occupancy in Eed+/+ and Eed−/− mESCs.

H2AK119u1 是X染色体失活这个现象的marker， inactive X chromosome (Xi)  ，作者又设计了实验证明 Xi现象就是 RYBP-PRC1造成的，而且不依赖于 H3K27me3。

为了探究 RYBP 在维持H2AK119u1水平的发挥的直接功能。然后又设计几种shRNA hairpins 来去除 RYBP ，在 Eed+/+and Eed−/− mESCs 探究 H2AK119u1水平，结果 RYBP knockdown的确显著的降低了H2AK119u1水平，在这两种细胞系。但是作者发现了一个附加现象，去除RYBP 几乎无法维持干细胞的未分化状态，而且RING1B 水平也显著下降。

RYBP and Cbx7 Define Specific Biological Functions of Polycomb Complexes in Mouse Embryonic Stem Cells

PRC1的组分异常复杂，包括 Cbx (Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, or Cbx8); Ring1A or Ring1B; PHC (PHC1, PHC2, or PHC3); PCGF (PCGF1, PCGF2, PCGF3, PCGF4, PCGF5, or PCGF6); and RYBP or YAF2.

其中，a Ring1A/B E3 ligase subunit that monoubiquitinates histone H2A at lysine 119 (H2AK119ub)

但不是说都必须要有，而是它们的组合，形成了各种各样的PRC1，但是都统一叫做PRC1。

比如在mouse的ESCs里面，就有两种PRC1，它们的 Cbx7 or RYBP 是不可能共存的！我们可以把它们分别叫做， Cbx7-PRC1, RYBP-PRC1

Cbx7 的功能是把 Ring1B 招募到染色质上面，是必须的。它结合的基因多参与 early-lineage commitment of ESCs.

RYBP 可以增强PRC1的酶活性，它结合的基因大多参与，regulation of metabolism and cell-cycle progression

RYBP 结合的基因要比 CBX7 结合的基因表达量高。 因为CBX7结合的同时，会招募PRC2这个抑制marker。

而PRC2 deposits the histone H3 lysine 27 trimethyl repressive mark (H3K27me3) through the Ezh1/2 histone methyltransferase enzymes.

如何描述它们这些peaks的交叉情况呢？

We observed an overlap of RYBP peaks (3,918 in total) with 14%, 42%, and 37% of Cbx7, Ring1B, and Suz12 peaks, respectively

Moreover, although more than 90% of Cbx7 peaks contained Ring1B and Suz12, 20% were also bound by RYBP

尽管RYBP and Cbx7 在大部分情况下都是互相排斥的，但是也在少部分基因组区域存在共定位的现象。

Ring1B / Suz12的peaks情况可以被 Cbx7 和 RYBP 的peaks情况说明：

RYBP and Cbx7 都有的地方，有着高Ring1B/Suz12

Cbx7 but not RYBP的地方，Ring1B/Suz12会稍微低一点

RYBP but not Cbx7的地方，Ring1B/Suz12会更低一点

RYBP and Cbx7 都没有的地方，Ring1B/Suz12就最少！

RYBP的peaks的中点在TSS处，而其它peaks都在TSS下游一点点。

用Sequential ChIP (re-ChIP)实验的确可以看到RYBP和CBX7的peaks有重合。

而且RYBP还有一些peaks是其它PRC1所没有的，说明它可以独立于PRC1发挥作用

H2AK119ub 与 Ring1B/Suz12正相关，但是与RYBP只有25.7%交叉，与CBX7有着72%交叉，所以可以把 PRC1 target genes分成3类：

a first set with Cbx7/Ring1B/H2AK119ub; ~~~~GO/KEGG分析，

a second that contains RYBP and lower levels of Ring1B/H2AK119ub

a third set cobound by RYBP/Cbx7/Ring1B and that also contains H2AK119ub.

然后这些所有的gene list都可以拿去做GO/KEGG分析，看看是不是有什么biological meaning ！

genes co-occupied by Ring1B/Cbx7/RYBP and H2AK119ub are involved in system development.

genes containing RYBP/Ring1B/H2AK119ub, but not Cbx7, have a strong association with the M phase of the meiotic cycle and cellular metabolism

genes with Cbx7/Ring1B/H2AK119ub are involved in developmental processes and mesoderm specification,

those containing RYBP/Cbx7/Ring1B/H2AK119ub predominantly represent the ectodermal fate and, to a lesser extent, mesoderm and endoderm fates

超过700的基因有 RYBP/Cbx7/Ring1B的peaks，所以作者敲除 Cbx7 看看 RYBP的peaks是否会变化，但是没有做CHIP-seq，只是做了ChIP-qPCR

下面这个结论很重要：

Overall, our ChIP-seq analysis allowed us to identify five types of genes according to the occupancy of PRC1 and PRC2: those with

(1) Ring1B/Cbx7/RYBP and Suz12 (725 genes);

(2) Ring1B/Cbx7/Suz12, but not RYBP (1,527 genes);

(3) Ring1B/RYBP/Suz12, but not Cbx7 (861 genes);

(4) only Ring1B and Suz12 (1,694 genes); or

(5) RYBP but no Polycomb proteins (1,674)

我用两个小时，不代表你是两个小时就学会，有些朋友反映学了两个星期才 学会，这很正常，没毛病，不要异想天开两个小时就达到我的水平。

本次讲解选取的文章是为了探索PRC1，PCR2这样的蛋白复合物，不是转录因子或者组蛋白的CHIP-seq，请注意区别！

这是一个系列帖子，你可以先看：

文章是：RYBP and Cbx7 define specific biological functions of polycomb complexes in mouse embryonic stem cells

RYBP and Cbx7都是Polycomb repressive complex 1 (PRC1)的组分：

数据都在：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE42466

所以用脚本在ftp里面批量下载即可：

下载地址很容易获取啦！

for ((i=204;i<=209;i++)) ;do wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620$i/SRR620$i.sra;done

ls *sra |while read id; do ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump --split-3 $id;done

因为我用fastqc看了看数据质量，代码如下：

ls *fastq |xargs ~/biosoft/fastqc/FastQC/fastqc -t 10

发现3端质量有点问题，我就用了-3 5 --local参数，

首先用bowtie2软件把测序得到的fastq文件比对到mm10参考基因组上面

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620204.fastq| samtools sort -O bam -o ring1B.bam

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620205.fastq| samtools sort -O bam -o cbx7.bam

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620206.fastq| samtools sort -O bam -o suz12.bam

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620207.fastq| samtools sort -O bam -o RYBP.bam

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620208.fastq| samtools sort -O bam -o IgGold.bam

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -p 6 -3 5 --local -x ~/reference/index/bowtie/mm10 -U SRR620209.fastq| samtools sort -O bam -o IgG.bam

nohup ~/.local/bin/macs2 callpeak -c ../IgGold.bam -t ../suz12.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n suz12 2>suz12.masc2.log &

nohup ~/.local/bin/macs2 callpeak -c ../IgGold.bam -t ../ring1B.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n ring1B 2>ring1B.masc2.log &

nohup ~/.local/bin/macs2 callpeak -c ../IgG.bam -t ../cbx7.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n cbx7 2>cbx7.masc2.log &

nohup ~/.local/bin/macs2 callpeak -c ../IgG.bam -t ../RYBP.bam -m 10 30 -p 1e-5 -f BAM -g mm -n RYBP 2>RYBP.masc2.log &

大家可以看到RYBP这个CHIP-seq我几乎得不到peaks，哪怕是换了一个control，除非我不用任何control！我用IGV看了看，这个RYBP的确很诡异，我怀疑是作者上传数据出错了！

而且作者在GEO给的PEAKS个数如下：

2754 GSE42466_Cbx7_peaks_10.txt
6982 GSE42466_Ring1b_peaks_10.txt
6872 GSE42466_RYBP_peaks_5.txt
8054 GSE42466_Suz12_peaks_10.txt

首先对这些bam文件批量转换成bw文件。然后批量画图

ls ../*bam |while read id

do

file=$(basename $id )

sample=${file%%.*}

echo $sample

bamCoverage -b $id -o $sample.bw ## 这里有个参数，-p 10 --normalizeUsingRPKM

computeMatrix reference-point --referencePoint TSS -b 10000 -a 10000 -R ~/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed -S $sample.bw --skipZeros -o matrix1_${sample}_TSS.gz --outFileSortedRegions regions1_${sample}_genes.bed

plotHeatmap -m matrix1_${sample}_TSS.gz -out ${sample}.png

done

然后整合所有的chipseq的bam文件，画基因的TSS附近的profile和heatmap图

computeMatrix reference-point -p 10 --referencePoint TSS -b 2000 -a 2000 -S ../*bw -R ~/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed --skipZeros -o tmp4.mat.gz

plotHeatmap -m tmp4.mat.gz -out tmp4.merge.png

plotProfile --dpi 720 -m tmp4.mat.gz -out tmp4.profile.pdf --plotFileFormat pdf --perGroup

plotHeatmap --dpi 720 -m tmp4.mat.gz -out tmp4.merge.pdf --plotFileFormat pdf

最后整合所有的chipseq的bam文件，画基因的genebody附近的profile和heatmap图

computeMatrix scale-regions -p 10 -S ../*bw -R ~/annotation/CHIPseq/mm10/ucsc.refseq.bed -b 3000 -a 3000 -m 5000 --skipZeros -o tmp5.mat.gz

plotHeatmap -m tmp5.mat.gz -out tmp5.merge.png

plotProfile --dpi 720 -m tmp5.mat.gz -out tmp5.profile.pdf --plotFileFormat pdf --perGroup

plotHeatmap --dpi 720 -m tmp5.mat.gz -out tmp5.merge.pdf --plotFileFormat pdf

下面是输出的图的例子，我只放了tss附近的！

上图可以看到RYBP的peaks的中点在TSS处，而其它peaks都在TSS下游一点点。

用Sequential ChIP (re-ChIP)实验的确可以看到RYBP和CBX7的peaks有重合。

这篇文章一直翻来覆去说 这些CHIP-seq实验的peaks的交叉情况：

PRC1的组分异常复杂，包括 Cbx (Cbx2, Cbx4, Cbx6, Cbx7, or Cbx8); Ring1A or Ring1B; PHC (PHC1, PHC2, or PHC3); PCGF (PCGF1, PCGF2, PCGF3, PCGF4, PCGF5, or PCGF6); and RYBP or YAF2.
其中，a Ring1A/B E3 ligase subunit that monoubiquitinates histone H2A at lysine 119 (H2AK119ub)
但不是说都必须要有，而是它们的组合，形成了各种各样的PRC1，但是都统一叫做PRC1。
比如在mouse的ESCs里面，就有两种PRC1，它们的 Cbx7 or RYBP 是不可能共存的！我们可以把它们分别叫做， Cbx7-PRC1, RYBP-PRC1Cbx7 的功能是把 Ring1B 招募到染色质上面，是必须的。它结合的基因多参与 early-lineage commitment of ESCs.
RYBP 可以增强PRC1的酶活性，它结合大基因多参与，regulation of metabolism and cell-cycle progression
RYBP 结合的基因要比 CBX7 结合的基因表达量高。 因为CBX7结合的同时，会招募PRC2这个抑制marker。
而PRC2 deposits the histone H3 lysine 27 trimethyl repressive mark (H3K27me3) through the Ezh1/2 histone methyltransferase enzymes.如何描述它们这些peaks的交叉情况呢？
We observed an overlap of RYBP peaks (3,918 in total) with 14%, 42%, and 37% of Cbx7, Ring1B, and Suz12 peaks, respectively
Moreover, although more than 90% of Cbx7 peaks contained Ring1B and Suz12, 20% were also bound by RYBP
尽管RYBP and Cbx7 在大部分情况下都是互相排斥的，但是也在少部分基因组区域存在共定位的现象。Ring1B / Suz12的peaks情况可以被 Cbx7 和 RYBP 的peaks情况说明：
RYBP and Cbx7 都有的地方，有着高Ring1B/Suz12
Cbx7 but not RYBP的地方，Ring1B/Suz12会稍微低一点
RYBP but not Cbx7的地方，Ring1B/Suz12会更低一点
RYBP and Cbx7 都没有的地方，Ring1B/Suz12就最少！RYBP的peaks的中点在TSS处，而其它peaks都在TSS下游一点点。
用Sequential ChIP (re-ChIP)实验的确可以看到RYBP和CBX7的peaks有重合。而且RYBP还有一些peaks是其它PRC1所没有的，说明它可以独立于PRC1发挥作用H2AK119ub 与 Ring1B/Suz12正相关，但是与RYBP只有25.7%交叉，与CBX7有着72%交叉，所以可以把 PRC1 target genes分成3类：
a first set with Cbx7/Ring1B/H2AK119ub; ~~~~GO/KEGG分析，
a second that contains RYBP and lower levels of Ring1B/H2AK119ub
a third set cobound by RYBP/Cbx7/Ring1B and that also contains H2AK119ub.

然后这些所有的gene list都可以拿去做GO/KEGG分析，看看是不是有什么biological meaning ！
genes co-occupied by Ring1B/Cbx7/RYBP and H2AK119ub are involved in system development.
genes containing RYBP/Ring1B/H2AK119ub, but not Cbx7, have a strong association with the M phase of the meiotic cycle and cellular metabolism
genes with Cbx7/Ring1B/H2AK119ub are involved in developmental processes and mesoderm specification,
those containing RYBP/Cbx7/Ring1B/H2AK119ub predominantly represent the ectodermal fate and, to a lesser extent, mesoderm and endoderm fates

超过700的基因有 RYBP/Cbx7/Ring1B的peaks，所以作者敲除Cbx7 看看 RYBP的peaks是否会变化，但是没有做CHIP-seq，只是做了ChIP-qPCR

下面这个结论很重要：
Overall, our ChIP-seq analysis allowed us to identify five types of genes according to the occupancy of PRC1 and PRC2: those with
(1) Ring1B/Cbx7/RYBP and Suz12 (725 genes);
(2) Ring1B/Cbx7/Suz12, but not RYBP (1,527 genes);
(3) Ring1B/RYBP/Suz12, but not Cbx7 (861 genes);
(4) only Ring1B and Suz12 (1,694 genes); or
(5) RYBP but no Polycomb proteins (1,674)