生信菜鸟团 » DESeq2 http://www.bio-info-trainee.com 欢迎去论坛biotrainee.com留言参与讨论，或者关注同名微信公众号biotrainee Sat, 28 Jun 2025 14:30:13 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=4.1.33 我用rmarkdown写过的教程 http://www.bio-info-trainee.com/2372.html http://www.bio-info-trainee.com/2372.html#comments Wed, 15 Mar 2017 09:16:05 +0000 http://www.bio-info-trainee.com/?p=2372 Continue reading →]]> 用rmarkdown写教程真心非常方便，尤其是R语言相关的，比如一些R包的应用，或者一些可视化，或者一些统计，下面我简单列出一些我以前写过的，图文并茂，关键是还非常省心，不需要排版，不需要上传图片，整理图片。

一般来说看链接最后的文件名就知道这篇文章讲的是什么了：

下面是一个统计学里面的逻辑分析的讲解
下面是一个表达矩阵的15个常见的可视化图形的制作：

用deconstructSigs来做cosmic的mutation signature图

这个史上最全方差分析，不是我写的，但是写的很赞，我就不多此一举了：

下面是一堆高通量测序分析的结题报告：

 简单 RNA-seq 项目结题报告
16s rDNA 高变区测序 项目结题报告
]]> http://www.bio-info-trainee.com/2372.html/feed 0 自学miRNA-seq分析第六讲~miRNA表达量差异分析 http://www.bio-info-trainee.com/1714.html http://www.bio-info-trainee.com/1714.html#comments Fri, 01 Jul 2016 15:11:26 +0000 http://www.bio-info-trainee.com/?p=1714 Continue reading →]]> 这一讲是miRNA-seq数据分析的分水岭，前面的5讲说的是读文献下载数据比对然后计算表达量，属于常规的流程分析，一般在公司测序之后都可以拿到分析结果，或者文献也会给出下载结果。但是单纯的分析一个样本意义不大，一般来说，我们做研究都是针对于不同状态下的miRNA表达量差异分析，然后做注释，功能分析，网络分析，这才是重点，也是难点。我这里就直接拿文献处理好的miRNA表达量来展示如何做下游分析，首先就是差异分析啦：根据文献，我们可以知道样本的分类情况是:

GSM1470353: control-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq   SRR1542714
GSM1470354: ET1-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq  SRR1542715
GSM1470355: control-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-SeqSRR1542716
GSM1470356: ET1-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542717
GSM1470357: control-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542718
GSM1470358: ET1-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542719
可以看到是6个样本的测序数据，分成两组，就是ET1刺激了CM细胞系前后对比而已！
同时，我们也拿到了这6个样本的表达矩阵，计量单位是counts的reads数，所以我们一般会选用DESeq2，edgeR这样的常用包来做差异分析，当然，做差异分析的工具还有十几个，我这里只是拿一根最顺手的举例子，就是DESeq2
下面的代码有点长，因为我在bioconductor系列教程里面多次提到了DESeq2使用方法，这里就只贴出代码，反正我要说的重点就是，我们进行了差异分析，然后得到差异miRNA列表
### step8: differential expression analysis by R package for miRNA expression patterns:
## 文章里面提到的结果是：
MicroRNA sequencing revealed over 250 known and 34 predicted novel miRNAs to be differentially expressed between ET-1 stimulated and unstimulated control hiPSC-CMs.
## (FDR < 0.1 and 1.5 fold change)
rm(list=ls())
setwd('J:\\miRNA_test\\paper_results')  ##把从GEO里面下载的文献结果放在这里
sampleIDs=c()
groupList=c()
allFiles=list.files(pattern = '.txt')
i=allFiles[1]
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
dat=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(dat)=c('miRNA',sampleID)
groupList=c(groupList,treat)
for (i in allFiles[-1]){
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
a=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(a)=c('miRNA',sampleID)
dat=merge(dat,a,by='miRNA')
groupList=c(groupList,treat)
}
### 上面的代码只是为了把6个独立的表达文件给合并成一个表达矩阵
## we need to filter the low expression level miRNA
exprSet=dat[,-1]
rownames(exprSet)=dat[,1]
suppressMessages(library(DESeq2))
exprSet=ceiling(exprSet)
(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), groupList=groupList))
## DESeq2就是这么简单的用
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~ groupList)
dds <- DESeq(dds)
png("qc_dispersions.png", 1000, 1000, pointsize=20)
plotDispEsts(dds, main="Dispersion plot")
dev.off()
res <- results(dds)
## 画一些图，相当于做QC吧
png("RAWvsNORM.png")
rld <- rlogTransformation(dds)
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet,  col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet[,1])
hist(exprSet_new[,1])
dev.off()library(RColorBrewer)
(mycols <- brewer.pal(8, "Dark2")[1:length(unique(groupList))])

# Sample distance heatmap
sampleDists <- as.matrix(dist(t(exprSet_new)))
#install.packages("gplots",repos = "http://cran.us.r-project.org")
library(gplots)
png("qc-heatmap-samples.png", w=1000, h=1000, pointsize=20)
heatmap.2(as.matrix(sampleDists), key=F, trace="none",
col=colorpanel(100, "black", "white"),
ColSideColors=mycols[groupList], RowSideColors=mycols[groupList],
margin=c(10, 10), main="Sample Distance Matrix")
dev.off()

png("MA.png")
DESeq2::plotMA(res, main="DESeq2", ylim=c(-2,2))
dev.off()
## 重点就是这里啦，得到了差异分析的结果
resOrdered <- res[order(res$padj),]
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
write.csv(resOrdered,"deseq2.results.csv",quote = F)

##下面也是一些图，主要是看看样本之间的差异情况
library(limma)
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1))
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1) - log(t( t(assays(dds)[["mu"]]) / sizeFactors(dds) ) + 1))
plotMDS( assays(dds)[["counts"]] )  ## raw count
plotMDS( assays(dds)[["mu"]] ) ##- fitted values.

最后我们得到的差异分析结果：deseq2.results.csv，就可以跟进FDR和fold change来挑选符合要求的差异miRNA啦
]]> http://www.bio-info-trainee.com/1714.html/feed 0 用R语言的DESeq2包来对RNA-seq数据做差异分析 http://www.bio-info-trainee.com/1533.html http://www.bio-info-trainee.com/1533.html#comments Mon, 11 Apr 2016 11:21:35 +0000 http://www.bio-info-trainee.com/?p=1533 Continue reading →]]> 我以前写过DESeq，以及过时了：http://www.bio-info-trainee.com/867.html

正好准备筹集bioconductor中文社区，我写简单讲一下DESeq2这个包如何用！

library(DESeq2)
library(limma)
library(pasilla)
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes)  ##做好表达矩阵
group_list=pasillaGenes$condition##做好分组因子即可

(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), group_list=group_list))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~ group_list)

##上面是第一步第一步，构建dds这个对象，需要一个表达矩阵和分组矩阵！！！

dds2 <- DESeq(dds)  ##第二步，直接用DESeq函数即可
resultsNames(dds2)
res <-  results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))
## 提取你想要的差异分析结果，我们这里是treated组对untreated组进行比较
resOrdered <- res[order(res$padj),]
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
可以看到程序非常好用！
它只对RNA-seq的基因的reads的counts数进行分析，请不要用RPKM等经过了normlization的表达矩阵来分析。
值得一提的是DESeq2软件独有的normlization方法！

rld <- rlogTransformation(dds2)  ## 得到经过DESeq2软件normlization的表达矩阵！
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet)
hist(exprSet_new)

QQ图片20160411191736

看这个图就知道了，它把本来应该是数据离散程度非常大的RNA-seq的基因的reads的counts矩阵经过normlization后变成了类似于芯片表达数据的表达矩阵，然后其实可以直接用T检验来找差异基因了！
但是，如果你的分组不只是两个，就复杂了，你需要再仔细研读说明书，甚至你可能需要咨询实验设计人员或者统计人员！
]]> http://www.bio-info-trainee.com/1533.html/feed 0