都来aviv Regev自于实验室，一系列文章都利用了单细胞转录组数据分析CNV。

2014年关于GBM的science文章

首先是2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，提到了这个分析点，然后还用了CCLE数据库验证可靠性。

该文章自己的单细胞转录组数据建库选用了 SMART-seq 方法，公布在 GSE57872

• 430(576) single glioblastoma cells isolated from 5 individual tumors
• 102(192) single cells from gliomasphere cells lines

这个单细胞转录组建库方式有点落后了：

SMART-seq protocol was implemented to generate single cell full length transcriptomes (modified from Shalek, et al Nature 2013) and sequenced using 25 bp paired end reads. Single cell cDNA libraries for MGH30 were resequenced using 100 bp paired end reads to allow for isoform and splice junction reconstruction (96 samples, annotated MGH30L).

所以作者过滤的比较严格，可以直接下载其分析好的表达矩阵，也可以下载原始测序数据自己走一波转录组流程。

第一次提出的公式如下：

2016年关于melanoma的science文章

然后是2016年关于melanoma的science文章：PMID: 27124452 也应用了单细胞转录组数据分析CNV，该文章的数据公布在 GSE72056 这次使用的Smart-seq2建库技术，共计 4645 个细胞，仅仅是表达矩阵就由71Mb，但是原始的测试数据在 dbGaP 数据库，需要申请才能下载。

we applied single-cell RNA sequencing (RNA-seq) to 4645 single cells isolated from 19 patients, profiling malignant, immune, stromal, and endothelial cells.

值得注意的是作者还做了bulk的转录组测序，针对6个处理 RAF or RAF+MEK inhibitors 前后供12个数据，公布在 GSE77940

这个时候的计算公式稍微有点变化了，如下：

2016年CELL杂志发表的关于头颈癌

接着是2016年CELL杂志发表的关于头颈癌的文章：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 测序如下；

We profiled transcriptomes of ∼6,000 single cells from 18 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, including five matched pairs of primary tumors and lymph node metastases.

同时也对这些病人测了whole-exome sequencing (WES) and targeted genotyping (SNaPshot) data，但是这些数据公布在 phs001474.v1.p1 ，不是很方便下载。

单细胞转录组建库用的Smart-seq2方法，所有的数据公布在 GSE103322 ， 仅仅是表达矩阵都有近100Mb了。

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz | 86.0 Mb |

下载地址是： (ftp)(http)

用CCLE数据做验证

2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，文章提到：

We downloaded the CCLE gene-centric RMA-normalized Affymetrix data (http://www.broadinstitute.org/ccle/), and centered the expression of each gene across all cell lines at zero.

需要简单注册后才能下载：https://portals.broadinstitute.org/ccle/users/sign_in

理论上要得到下面的图：

](http://www.bio-info-trainee.com/wp-content/uploads/2018/02/highly-correlated-CNV-by-SNP6array-and-RNA-seq.png)

说明使用转录组数据分析到的CNV情况和SNP6.0芯片的结果差异不大。

还有GTEx数据库的验证

To compare these patterns to an external reference of normal cells we downloaded RNA-Seq data from the GTEX portal (http://www.gtexportal.org/; gene read counts file from Jan. 2013), and estimated CNV values as above: we normalized the read counts into log2(TPM+1), averaged all brain samples, restricted the data to the ~6,000 analyzed genes, subtracted for each gene the average normalized expression from the GBM single-cell data (this step is comparable to the centering of the single cell data) and then used a moving average of 100 genes over the genomically-ordered list of genes to define CNV-cont.

总结

上述文章及数据都是有表达矩阵可以下载，所以仅仅是根据这些文章的补充材料公布的公式即可重复整个流程啦。

有两个难点，一是在linux下面安装matlab工作环境，二是如何制作输入文件。

二、输入数据准备

用picnic或者birdseed等软件处理snp6.0芯片的raw data之后得到的segment文件

多个样本的segment合并起来作为输入数据，还有样本列表，芯片的一些信息，根据示例文件，很容易做出input文件！

arraylistfile就是你本次运行GISTIC软件所涉及到的所有样本，一般一个癌种一起运行。

cnvfiles可以不用。

segmentationfile.txt 就是你snp6.0等芯片运行得到的segment信息，把所有样本的结果合并在一起，一般一个样本的segment有1000千左右

markersfile.txt主要取决于你的芯片平台，如果是affymetrix的snp6.0芯片，会有90多万行数据，每个探针的信息都有。

软件自带的测试数据如上，可以看到是106个样本，总共是两万多segment信息，那么也就意味着平均每个样本才200个，可能是snp6.0芯片数据的PICNIC软件的结果。但是它的

markersfile.txt 明确写着才十多万mark，也就是探针，所以应该不是

snp6.0芯片

    106 arraylistfile.txt

  12942 cnvfile.txt

 115593 markersfile.txt

  20521 segmentationfile.txt

三、程序使用

软件提供的运行脚本使用的是csh，我修改成了bash

还需要修改matlab的路径及基因组版本信息

简单解释下输出的目录下的文件

all_data_by_genes.txt 代表了基因（包括非编码RNA如miRNA，lncRNA）在样本中具体的拷贝数值。

all_lesions.conf_90.txt 代表识别的拷贝数扩增和缺失Peak区域。

all_thresholded.by_genes.txt 代表离散化之后的数值，如-2代表丢失两个拷贝，-1代表丢失一个拷贝,0代表拷贝数正常,1代表增加一个拷贝，2代表扩增两个拷贝。

broad_significance_results.txt代表显著发生拷贝数变异的broad区域。

broad_values_by_arm.txt 代表染色体臂在样本中的拷贝数数值。

scores.gistic代表通过该方法打分之后的结果。