都来aviv Regev自于实验室，一系列文章都利用了单细胞转录组数据分析CNV。

2014年关于GBM的science文章

首先是2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，提到了这个分析点，然后还用了CCLE数据库验证可靠性。

该文章自己的单细胞转录组数据建库选用了 SMART-seq 方法，公布在 GSE57872

• 430(576) single glioblastoma cells isolated from 5 individual tumors
• 102(192) single cells from gliomasphere cells lines

这个单细胞转录组建库方式有点落后了：

SMART-seq protocol was implemented to generate single cell full length transcriptomes (modified from Shalek, et al Nature 2013) and sequenced using 25 bp paired end reads. Single cell cDNA libraries for MGH30 were resequenced using 100 bp paired end reads to allow for isoform and splice junction reconstruction (96 samples, annotated MGH30L).

所以作者过滤的比较严格，可以直接下载其分析好的表达矩阵，也可以下载原始测序数据自己走一波转录组流程。

第一次提出的公式如下：

2016年关于melanoma的science文章

然后是2016年关于melanoma的science文章：PMID: 27124452 也应用了单细胞转录组数据分析CNV，该文章的数据公布在 GSE72056 这次使用的Smart-seq2建库技术，共计 4645 个细胞，仅仅是表达矩阵就由71Mb，但是原始的测试数据在 dbGaP 数据库，需要申请才能下载。

we applied single-cell RNA sequencing (RNA-seq) to 4645 single cells isolated from 19 patients, profiling malignant, immune, stromal, and endothelial cells.

值得注意的是作者还做了bulk的转录组测序，针对6个处理 RAF or RAF+MEK inhibitors 前后供12个数据，公布在 GSE77940

这个时候的计算公式稍微有点变化了，如下：

2016年CELL杂志发表的关于头颈癌

接着是2016年CELL杂志发表的关于头颈癌的文章：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 测序如下；

We profiled transcriptomes of ∼6,000 single cells from 18 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, including five matched pairs of primary tumors and lymph node metastases.

同时也对这些病人测了whole-exome sequencing (WES) and targeted genotyping (SNaPshot) data，但是这些数据公布在 phs001474.v1.p1 ，不是很方便下载。

单细胞转录组建库用的Smart-seq2方法，所有的数据公布在 GSE103322 ， 仅仅是表达矩阵都有近100Mb了。

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz | 86.0 Mb |

下载地址是： (ftp)(http)

用CCLE数据做验证

2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，文章提到：

We downloaded the CCLE gene-centric RMA-normalized Affymetrix data (http://www.broadinstitute.org/ccle/), and centered the expression of each gene across all cell lines at zero.

需要简单注册后才能下载：https://portals.broadinstitute.org/ccle/users/sign_in

理论上要得到下面的图：

](http://www.bio-info-trainee.com/wp-content/uploads/2018/02/highly-correlated-CNV-by-SNP6array-and-RNA-seq.png)

说明使用转录组数据分析到的CNV情况和SNP6.0芯片的结果差异不大。

还有GTEx数据库的验证

To compare these patterns to an external reference of normal cells we downloaded RNA-Seq data from the GTEX portal (http://www.gtexportal.org/; gene read counts file from Jan. 2013), and estimated CNV values as above: we normalized the read counts into log2(TPM+1), averaged all brain samples, restricted the data to the ~6,000 analyzed genes, subtracted for each gene the average normalized expression from the GBM single-cell data (this step is comparable to the centering of the single cell data) and then used a moving average of 100 genes over the genomically-ordered list of genes to define CNV-cont.

总结

上述文章及数据都是有表达矩阵可以下载，所以仅仅是根据这些文章的补充材料公布的公式即可重复整个流程啦。

## Download and install HISAT

# https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml

cd ~/biosoft

mkdir HISAT && cd HISAT

#### readme: https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/manual.shtml

wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/downloads/hisat2-2.0.4-Linux_x86_64.zip

unzip hisat2-2.0.4-Linux_x86_64.zip

ln -s hisat2-2.0.4 current

## ~/biosoft/HISAT/current/hisat2-build

## ~/biosoft/HISAT/current/hisat2

## Download and install StringTie

## https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/ ## https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml?t=manual

cd ~/biosoft

mkdir StringTie && cd StringTie

wget http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/dl/stringtie-1.2.3.Linux_x86_64.tar.gz

tar zxvf stringtie-1.2.3.Linux_x86_64.tar.gz

ln -s stringtie-1.2.3.Linux_x86_64 current

# ~/biosoft/StringTie/current/stringtie

while read id

do

sample=$(echo $id |cut -d" " -f 1 )

file1=$(echo $id |cut -d" " -f 2 )

file2=$(echo $id |cut -d" " -f 3 )

echo  $sample

echo $file1

echo $file2

~/biosoft/HISAT/current/hisat2  -p 4 --dta  -x  ~/reference/index/hisat/hg19/genome  -1 $file1 -2 $file2 -S $sample.hisat2.hg19.sam 2>$sample.hisat2.hg19.log &

done <$1

上面这个脚本需要一个3列的输入文件，分别是样本名，read1文件，read2文件，会产生以下的输出文件，sam文件。

while read id

do

file=$(basename $id )

sample=${file%%.*}

echo $id $sample

nohup samtools sort -@ 4 -o ${sample}.sorted.bam $id &

done <$1

最新版的samtools已经可以直接把sam文件变成排序好的bam文件啦~~~~

while read id

do

file=$(basename $id )

sample=${file%%.*}

echo $id $sample

nohup ~/biosoft/StringTie/current/stringtie  -p 4  -G ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf  -o $sample.hg19.stringtie.gtf -l $sample  $id  &

done <$1

stringTie的用法就是这样咯。没什么好讲的

 ~/biosoft/StringTie/current/stringtie   --merge -p 8 -G ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf  -o stringtie_merged.gtf  mergelist.txt

while read id

do

file=$(basename $id )

sample=${file%%.*}

echo $id $sample

nohup ~/biosoft/StringTie/current/stringtie -e -B  -G  $2  -o ballgown/$sample/$sample.hg19.stringtie.gtf   $id  &

done <$1

使用Bedtools对RNA-seq进行基因计数 ，

转录组HTseq对基因表达量进行计数

言归正传，我这里没精力去探究它们的具体原理，只是看看它们数一个read是否属于某个基因的时候，区别在哪里，大家看下图：

nohup samtools view control.Nsort.bam | ~/.local/bin/htseq-count -f sam -s no -i gene_name - ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf 1>control.geneCounts 2>control.HTseq.log &

nohup samtools view G34V.Nsort.bam | ~/.local/bin/htseq-count -f sam -s no -i gene_name - ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf 1>G34V.geneCounts 2>G34V.HTseq.log &

nohup samtools view K27M.Nsort.bam | ~/.local/bin/htseq-count -f sam -s no -i gene_name - ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf 1>K27M.geneCounts 2>K27M.HTseq.log &

nohup samtools view WT.Nsort.bam | ~/.local/bin/htseq-count -f sam -s no -i gene_name - ~/reference/gtf/gencode/gencode.v25lift37.annotation.gtf 1>WT.geneCounts 2>WT.HTseq.log &

本来我是准备自己写脚本对sam文件进行counts就好，但是发现了samtools自带这样的工具：http://www.htslib.org/doc/samtools.html 

如果是针对基因组序列，那么这个功能用处不大，但是针对转录本序列，统计出来的就是我们想要的转录本表达量。

samtools idxstats tmp.bowtie2.sorted.bam |head
TR3|c0_g1_i1 1276 418 0
TR6|c0_g1_i1 1271 10 0
TR6|c0_g1_i2 944 5 0
TR6|c0_g1_i3 1281 4 0
TR6|c0_g1_i4 1224 53 0
TR6|c0_g1_i5 855 16 0
TR19|c0_g1_i2 1428 19 0
TR19|c0_g1_i3 2536 624 0
TR19|c0_g1_i4 3072 105 0
TR19|c0_g1_i5 1685 0 0

软件官网说明书，说的很清楚：

samtools idxstats in.sam|in.bam|in.cram

Retrieve and print stats in the index file corresponding to the input file. Before calling idxstats, the input BAM file must be indexed by samtools index.

The output is TAB-delimited with each line consisting of reference sequence name, sequence length, # mapped reads and # unmapped reads. It is written to stdout.

第三列，就是我们想要的表达量数据啦，比对到每个转录本序列的reads数量。

大家从我的转录本序列ID上面如果可以看出些什么问题，欢迎跟我交流，直接给我email就好了，jmzeng1314@163.com 

现在知道了每个转录本的表达量，把每个样本都做一下，就知道表达矩阵了，做差异分析就很简单了。但是得到的是差异转录本列表，不明白这些ID背后的意义，需要取注释，才能做下一步分析。

ls *sorted.bam |while read id
do
echo $id ${id%%.*}.t.counts
nohup samtools idxstats $id 1>${id%%.*}.t.counts 2>/dev/null  &
done

搜索可以得到非常多的流程，我这里简单分享一些，我以前搜索到的文献。

北大也有讲RNA-seq的原理

链接：http://pan.baidu.com/s/1kTmWmv9 密码：6yaz

甚至，我还有个华大的培训课程！！！这可是5天的培训教程哦，好像当初还花了五千多块钱的资料！！！

链接：http://pan.baidu.com/s/1nt5OV5B 密码：gyul

优酷也有视频，可以自己搜索看看

然后还有几个pipeline，就是生信的分析流程，即使你啥都不会，按照pipeline来也不是问题啦

export PATH=/share/software/bin:$PATH

bowtie2-build ./data/GRCh37_chr21.fa  chr21

tophat -p 1 -G ./data/genes.gtf -o P460.thout chr21 ./data/P460_R1.fq  ./data/P460_R2.fq

tophat -p 1 -G ./data/genes.gtf -o C460.thout chr21 ./data/C460_R1.fq  ./data/C460_R2.fq

cufflinks -p 1 -o P460.clout P460.thout/accepted_hits.bam

cufflinks -p 1 -o C460.clout C460.thout/accepted_hits.bam

samtools  view  -h  P460.thout/accepted_hits.bam  >  P460.thout/accepted_hits.sam

samtools  view  -h  C460.thout/accepted_hits.bam  >  C460.thout/accepted_hits.sam

echo ./P460.clout/transcripts.gtf > assemblies.txt

echo ./C460.clout/transcripts.gtf >> assemblies.txt

cuffmerge -p 1 -g ./data/genes.gtf -s ./data/GRCh37_chr21.fa  assemblies.txt

cuffdiff -p 1 -u merged_asm/merged.gtf  -b ./data/GRCh37_chr21.fa  -L P460,C460 -o P460-C460.diffout P460.thout/accepted_hits.bam C460.thout/accepted_hits.bam

samtools  index  P460.thout/accepted_hits.bam

samtools  index  C460.thout/accepted_hits.bam

和另外一个

#!/bin/bash

# Approx 75-80m to complete as a script

cd ~/RNA-seq

ls -l data

tophat --help

head -n 20 data/2cells_1.fastq

time tophat --solexa-quals \

-g 2 \

--library-type fr-unstranded \

-j annotation/Danio_rerio.Zv9.66.spliceSites\

-o tophat/ZV9_2cells \

genome/ZV9 \

data/2cells_1.fastq data/2cells_2.fastq                  # 17m30s

time tophat --solexa-quals \

-g 2 \

--library-type fr-unstranded \

-j annotation/Danio_rerio.Zv9.66.spliceSites\

-o tophat/ZV9_6h \

genome/ZV9 \

data/6h_1.fastq data/6h_2.fastq                          # 17m30s

samtools index tophat/ZV9_2cells/accepted_hits.bam

samtools index tophat/ZV9_6h/accepted_hits.bam

cufflinks --help

time cufflinks  -o cufflinks/ZV9_2cells_gff \

-G annotation/Danio_rerio.Zv9.66.gtf \

-b genome/Danio_rerio.Zv9.66.dna.fa \

-u \

--library-type fr-unstranded \

tophat/ZV9_2cells/accepted_hits.bam                  # 2m

time cufflinks  -o cufflinks/ZV9_6h_gff \

-G annotation/Danio_rerio.Zv9.66.gtf \

-b genome/Danio_rerio.Zv9.66.dna.fa \

-u \

--library-type fr-unstranded \

tophat/ZV9_6h/accepted_hits.bam                      # 2m

# guided assembly

time cufflinks  -o cufflinks/ZV9_2cells \

-g annotation/Danio_rerio.Zv9.66.gtf \

-b genome/Danio_rerio.Zv9.66.dna.fa \

-u \

--library-type fr-unstranded \

tophat/ZV9_2cells/accepted_hits.bam                  # 16m

time cufflinks  -o cufflinks/ZV9_6h \

-g annotation/Danio_rerio.Zv9.66.gtf \

-b genome/Danio_rerio.Zv9.66.dna.fa \

-u \

--library-type fr-unstranded \

tophat/ZV9_6h/accepted_hits.bam                      # 13m

time cuffdiff -o cuffdiff/ \

-L ZV9_2cells,ZV9_6h \

-T \

-b genome/Danio_rerio.Zv9.66.dna.fa \

-u \

--library-type fr-unstranded \

annotation/Danio_rerio.Zv9.66.gtf \

tophat/ZV9_2cells/accepted_hits.bam \

tophat/ZV9_6h/accepted_hits.bam                        # 7m

head -n 20 cuffdiff/gene_exp.diff

sort -t$'\t' -g -k 13 cuffdiff/gene_exp.diff \

> cuffdiff/gene_exp_qval.sorted.diff

head -n 20 cuffdiff/gene_exp_qval.sorted.diff

首先当然是我的转录组分类网站啦

http://www.bio-info-trainee.com/?cat=18

同样的我用脚本总结一下给大家

http://www.bio-info-trainee.com/?p=370阅读更多关于《转录组-GO和KEGG富集的R包clusterProfiler》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=359阅读更多关于《转录组-GO通路富集-WEGO网站使用》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=346阅读更多关于《转录组-TransDecoder-对trinity结果进行注释》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=271阅读更多关于《转录组cummeRbund操作笔记》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=255阅读更多关于《转录组edgeR分析差异基因》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=244阅读更多关于《转录组HTseq对基因表达量进行计数》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=166阅读更多关于《转录组cufflinks套装的使用》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=156阅读更多关于《转录组比对软件tophat的使用》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=125阅读更多关于《Trinity进行转录组组装的使用说明》

http://www.bio-info-trainee.com/?p=113阅读更多关于《RSeQC对 RNA-seq数据质控》

同时我也讲了如何下载数据

http://www.bio-info-trainee.com/?p=32

原始SRA数据首先用SRAtoolkit数据解压，然后进行过滤，评估质量，然后trinity组装，然后对组装好的进行注释，然后走另一条路进行差异基因，差异基因有tophat+cufflinks+cummeRbund，也有HTseq 和edgeR等等，然后是GO和KEGG通路注释，等等。

在我的群里面共享了所有的代码及帖子内容，欢迎加群201161227，生信菜鸟团！

http://www.bio-info-trainee.com/?p=1

线下交流-生物信息学
同时欢迎下载使用我的手机安卓APP

http://www.cutt.com/app/down/840375

这是跟tophat和cufflinks套装紧密搭配使用的一个R包，能出大部分文章要求的标准化图片。

一：安装并加装该R包

安装就用source("http://bioconductor.org/biocLite.R") ;biocLite("cummeRbund")即可，如果安装失败，就需要自己下载源码包，然后安装R模块。

然后把cuffdiff输出的文件目录拷贝到R的工作目录，或者自己设置工作目录

二：读取FN目录下面的所有文件。

可以看到把cuffdiff下面的文件夹所有的文件都读取到了，里面有如下文件，包括genes，isoforms，cds，tss这四种差异情况都读取了。

三：表达水平分布图

四、表达水平箱线图

csBoxplot(genes(cuff_data))

五、画基因表达差异热图

画出热图如下

六、得到差异的genes,isoforms,TSS,CDS等等

• 得到上调下调基因列表

diffData <- diffData(myGenes )

只有一百个有表达差异的基因

最后贴出一个综合性的代码，算了，太浪费空间了，把整个空间搞得不好看，就不贴了。

这个代码可以自动运行出图;