#我这里直接从GEO里面下载了peaks结果，它们详情如下：wc -l *bed
6768 GSM1278641_Xu_MUT_rep1_BAF155_MUT.peaks.bed
3660 GSM1278643_Xu_MUT_rep2_BAF155_MUT.peaks.bed
11022 GSM1278645_Xu_WT_rep1_BAF155.peaks.bed
5260 GSM1278647_Xu_WT_rep2_BAF155.peaks.bed
49458 GSM601398_Ini1HeLa-peaks.bed
24477 GSM601398_Ini1HeLa-peaks-stringent.bed
12725 GSM601399_Brg1HeLa-peaks.bed
12316 GSM601399_Brg1HeLa-peaks-stringent.bed
46412 GSM601400_BAF155HeLa-peaks.bed
37920 GSM601400_BAF155HeLa-peaks-stringent.bed
30136 GSM601401_BAF170HeLa-peaks.bed
25432 GSM601401_BAF170HeLa-peaks-stringent.bed

每个BED的peaks记录，本质是就3列是需要我们注意的，就是染色体，以及在该染色体上面的起始和终止坐标，如下：

#PeakID chr start end strand Normalized Tag Count region size findPeaks Score Clonal Fold Change
chr20 52221388 52856380 chr20-8088 41141 +
chr20 45796362 46384917 chr20-5152 31612 +
chr17 59287502 59741943 chr17-2332 29994 +
chr17 59755459 59989069 chr17-667 19943 +
chr20 52993293 53369574 chr20-7059 12642 +
chr1 121482722 121485861 chr1-995 9070 +
chr20 55675229 55855175 chr20-6524 7592 +
chr3 64531319 64762040 chr3-4022 7213 +
chr20 49286444 49384563 chr20-4482 6165 +

我们所谓的peaks注释，就是想看看该peaks在基因组的哪一个区段，看看它们在各种基因组区域(基因上下游，5,3端UTR，启动子，内含子，外显子，基因间区域，microRNA区域)分布情况，但是一般的peaks都有近万个，所以需要批量注释，如果脚本学的好，自己下载参考基因组的GFF注释文件，完全可以自己写一个，我这里会介绍一个R的bioconductor包ChIPpeakAnno来做CHIP-seq的peaks注释，下面的包自带的示例：

library(ChIPpeakAnno)
bed <- system.file("extdata", "MACS_output.bed", package="ChIPpeakAnno")
gr1 <- toGRanges(bed, format="BED", header=FALSE)
## one can also try import from rtracklayer
library(rtracklayer)
gr1.import <- import(bed, format="BED")
identical(start(gr1), start(gr1.import))
gr1[1:2]
gr1.import[1:2] #note the name slot is different from gr1
gff <- system.file("extdata", "GFF_peaks.gff", package="ChIPpeakAnno")
gr2 <- toGRanges(gff, format="GFF", header=FALSE, skip=3)
ol <- findOverlapsOfPeaks(gr1, gr2)
makeVennDiagram(ol)

##还可以用binOverFeature来根据特定的GRanges对象(通常是TSS)来画分布图
## Distribution of aggregated peak scores or peak numbers around transcript start sites.

可以看到这个包使用起来非常简单，只需要把我们做好的peaks文件(GSM1278641_Xu_MUT_rep1_BAF155_MUT.peaks.bed等等)用toGRanges或者import读进去，成一个GRanges对象即可，上面的代码是比较两个peaks文件的overlap。然后还可以根据R很多包都自带的数据来注释基因组特征：

data(TSS.human.GRCh37) ## 主要是借助于这个GRanges对象来做注释，也可以用getAnnotation来获取其它GRanges对象来做注释
## featureType ： TSS, miRNA, Exon, 5'UTR, 3'UTR, transcript or Exon plus UTR
peaks=MUT_rep1_peaks
macs.anno <- annotatePeakInBatch(peaks, AnnotationData=TSS.human.GRCh37,
output="overlapping", maxgap=5000L)

## 得到的macs.anno对象就是已经注释好了的，每个peaks是否在基因上，或者距离基因多远，都是写的清清楚楚
if(require(TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)){
aCR<-assignChromosomeRegion(peaks, nucleotideLevel=FALSE,
precedence=c("Promoters", "immediateDownstream",
"fiveUTRs", "threeUTRs",
"Exons", "Introns"),
TxDb=TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene)
barplot(aCR$percentage)
}

得到的条形图如下，虽然很丑，但这就是peaks注释的精髓，搞清楚每个peaks在基因组的位置特征：

同理，对每个peaks文件，都可以做类似的分析！

但是对多个peaks文件，比如本文中的，想比较野生型和突变型MCF7细胞系的 BAF155 immunoprecipitates的结果的不同，就需要做peaks之间的差异分析，已经后续的差异基因注释啦

当然，值得一提的是peaks注释我更喜欢网页版工具，反正peaks文件非常小，直接上传到别人做好的web tools，就可立即出一大堆可视化图表分析结果啦，大家可以去试试看：

/home/jmzeng/bio-soft/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4  Sample3.varscan.snp.vcf > Sample3.annovar

/home/jmzeng/bio-soft/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4  Sample4.varscan.snp.vcf > Sample4.annovar

/home/jmzeng/bio-soft/annovar/convert2annovar.pl -format vcf4  Sample5.varscan.snp.vcf > Sample5.annovar

然后用下面这个脚本批量注释

Reading gene annotation from /home/jmzeng/bio-soft/annovar/humandb/hg19_refGene.txt ... Done with 50914 transcripts (including 11516 without coding sequence annotation) for 26271 unique genes

最后查看结果可知，真正在外显子上面的突变并不多

23515 Sample3.anno.exonic_variant_function

23913 Sample4.anno.exonic_variant_function

24009 Sample5.anno.exonic_variant_function

annovar软件就是把我们得到的十万多个snp分类了，看看这些snp分别是基因的哪些位置，是否引起蛋白突变

downstream

exonic

exonic;splicing

intergenic

intronic

ncRNA_exonic

ncRNA_intronic

ncRNA_splicing

ncRNA_UTR3

ncRNA_UTR5

splicing

upstream

upstream;downstream

UTR3

UTR5

UTR5;UTR3

一．首先把snp-calling步骤的VCF文件转为annovar软件要求的格式

convert2annovar.pl   -format vcf4   12.vcf >12.annovar

二．进行注释

命令行参数比较多，还是用脚本来运行

# define path

infolder=/home/jmzeng/hoston/diff

outfolder=$infolder

annovardb=/home/jmzeng/bio-soft/annovar/humandb

# start annotating

/home/jmzeng/bio-soft/annovar/annotate_variation.pl \

--buildver hg19 \

--geneanno \

--outfile ${outfolder}/12.anno \

${infolder}/12.annovar  \

${annovardb}

三．输出结果解读

2.6M Apr 14 22:32 12.anno.exonic_variant_function

1.9K Apr 14 22:32 12.anno.log

1.3M Apr 14 22:32 12.anno.variant_function

重点是后缀为exonic_variant_function，这个文件对每一个vcf的突变都进行了注释。

这个结果就可以用来解析了，可以根据实验设计来找到自己感兴趣的突变。

第5.6列是染色体及pos坐标

第4列信息非常复杂，是突变的注释

第12列是测序深度，一般要大于20

我这里是先把注释文件转换成以下格式

location:chr1:874467 SAMD11:NM_152486:exon6:c.G478A:p.D160N

location:chr1:888639 NOC2L:NM_015658:exon9:c.A918G:p.E306E

location:chr1:888659 NOC2L:NM_015658:exon9:c.A898G:p.I300V

location:chr1:916549 PERM1:NM_001291367:exon2:c.T58C:p.W20R

location:chr1:949608 ISG15:NM_005101:exon2:c.G248A:p.S83N

location:chr1:980552 AGRN:NM_198576:exon13:c.G2266A:p.A756T

location:chr1:1114699 TTLL10:NM_001130045:exon4:c.G104A:p.R35Q

location:chr1:1158631 SDF4:NM_016176:exon4:c.T570C:p.D190D

location:chr1:1158631 SDF4:NM_016547:exon4:c.T570C:p.D190D

location:chr1:1164073 SDF4:NM_016176:exon2:c.C101T:p.A34V

然后比较两个文件，取不同的突变来格式化输出。

其实，这是一个非常简单的事情，因为有了CHROM和pos，只要找到一个文件，就可以自己写脚本来映射到它的ID号，但是找这个文件比较困难，我也是搜索了好久才找到的。

http://varianttools.sourceforge.net/Annotation/DbSNP

这里面提到了最新版的数据库是dbSNP138

The default version of our dbSNP annotation is currently referring to dbSNP138 (using hg19 coordinates) as shown below. However, users can also retrieve older versions of dbSNP: db135, dbSNP129, dbSNP130, dbSNP131 and dbSNP132. The 129 and 130 versions use hg18 as a reference genome and 131, 132, 135 and later use hg19. The archived versions can be used by a variant tools project by referring to their specific names - for example: dbSNP-hg18_129.

所以我就换了关键词，终于搜的了

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_summary.cgi?view+summary=view+summary&build_id=138

http://asia.ensembl.org/info/genome/variation/sources_documentation.html?redirect=no

SNP 138 database (232,952,851 million altogether).

有一个bioconductor包是专门来做snp过滤的

http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/VariantAnnotation.html

首先下载vcf文件。

nohup wget ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/organisms/human_9606/VCF/00-All.vcf.gz &

这个文件很大，解压开是

如果大家对snp不了解，可以去查看它的各种介绍以及分类

http://moma.ki.au.dk/genome-mirror/cgi-bin/hgTrackUi?db=hg19&g=snp138

其实我这里本来有个hg19_snp141.txt文件，如下

1 10020 A - .

1 10108 C T .

1 10109 A T .

1 10139 A T .

1 10145 A - .

1 10147 C - .

1 10150 C T .

1 10177 A C .

1 10180 T C .

1 10229 A - .

还可以下载一些文件，如bed_chr_1.bed

chr1 175292542 175292543 rs171 0 -

chr1 20542967 20542968 rs242 0 +

chr1 6100897 6100898 rs538 0 -

chr1 93151988 93151989 rs546 0 +

chr1 15220328 15220329 rs549 0 +

chr1 203744004 203744005 rs568 0 +

chr1 23854550 23854551 rs665 0 -

chr1 53213656 53213657 rs672 0 +

chr1 173907422 173907423 rs677 0 -

当然还有那个ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/organisms/human_9606/VCF/00-All.vcf.gz  18G的文件，是VCF格式

##fileformat=VCFv4.0

##fileDate=20150218

##source=dbSNP

##dbSNP_BUILD_ID=142

##reference=GRCh38

#CHROM  POS     ID      REF     ALT     QUAL    FILTER  INFO

1       10108   rs62651026      C       T       .       .       RS=62651026;RSPOS=10108;dbSNPBuildID=129;SSR=0;SAO=0;VP=0x050000020005000002000100;WGT=1;VC=SNV;R5;ASP

所以这个文件就是我们想要的最佳文件，提取前三列就够啦

#CHROM  POS     ID

1 10108 rs62651026

1 10109 rs376007522

1 10139 rs368469931

1 10144 rs144773400

1 10150 rs371194064

1 10177 rs201752861

1 10177 rs367896724

1 10180 rs201694901

1 10228 rs143255646

1 10228 rs200462216

这样就可以通过脚本用hash把我们自己找到的hash跟数据库的rs编号对应起来啦

这个软件需要edu邮箱注册才能下载，可能是仅对科研高校开放吧。所以软件地址我就不列了。

它其实是几个perl程序，比较重要的是这个人类的数据库，snp注释必须的。

参考：http://annovar.readthedocs.org/en/latest/misc/accessory/

二，准备数据

既然是注释，那当然要有数据库啦！数据库倒是有下载地址

http://www.openbioinformatics.org/annovar/download/hg19_ALL.sites.2010_11.txt.gz

也可以用命令来下载

Perl ./annotate_variation.pl -downdb -buildver hg19 -webfrom annovar refGene humandb/

然后我们是对snp-calling流程跑出来的VCF文件进行注释，所以必须要有自己的VCF文件，VCF格式详解见本博客另一篇文章，或者搜索也行

http://vcftools.sourceforge.net/man_latest.html

三、运行的命令

首先把vcf格式文件，转换成空格分隔格式文件，自己写脚本也很好弄

perl convert2annovar.pl  -format vcf

/home/jmzeng/raw-reads/whole-exon/snp-calling/tmp1.vcf >annovar.input

变成了空格分隔的文件

然后把转换好的数据进行注释即可

./annotate_variation.pl -out ex1 -build hg19 example/ex1.avinput humandb/

四，输出文件解读

看看网站主页，看看它需要什么数据

http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/index.pl

二，所需要的数据

1，human.all.go.entrez，需要自己制作，每个基因名entrez ID号，对应着一堆GO通路，人有两万多个基因，所以应该有两万多行的文件。

2，差异基因的GO通路，需要用cuffdiff得到差异基因名，然后用然后用脚本做成下面的样子。记住，上面的那个人类的背景GO文件也是一样的格式，基因名是entrez ID号，与GO通路用制表符隔开，然后每个基因所对应的GO直接用空格隔开。格式要求很准确才行。

三，上传数据，出图

点击plot画图即可，就可以出来了一个GO通路富集图

顺便贴上wego上传数据制作的几个脚本，脚本这种东西都很难看，随便意思一下啦，用一下脚本处理就可以得到wego需要上传的数据了

1，得到差异基因名，并且转换为entrez ID号
grep yes gene_exp.diff |cut -f 3 |sort -u >diff.gene.name
cat diff.gene.name  ../Homo_sapiens.gene_info  |perl -alne '{$hash{$_}=1;print $F[1] if exists $hash{$F[2]}}' |sort -u >diff.gene.entrez
2，根据找到的差异基因的entrez ID号来找到它的GO信号，输出文件给wego网站
cat diff.gene.entrez ../gene2go |perl -alne '{$hash{$_}=1;print "$F[1]\t$F[2]" if exists $hash{$F[1]}}' |perl -alne '{$hash{$F[0]}.="$F[1] "}END{print "$_\t$hash{$_}" foreach keys %hash}' >diff.gene.entrez.go
3，得到entrez ID号跟ensembl ID号的转换hash表
perl -alne '{if (/Ensembl:(ENSG\d+)/) {print "$1=>$F[1]"} }' Homo_sapiens.gene_info >entrez.ensembl
4，得到人类entrez ID的go背景
grep '^9606' gene2go |perl -alne '{$hash{$F[1]}.="$F[2] "}END{print "$_\t$hash{$_}" foreach sort keys %hash}' >human.all.go.entrez
5，把人类entrez ID的go背景转换成ensembl的go背景
cat entrez.ensembl human.all.go.entrez |perl -F"=>" -alne  '{$hash{$F[1]}=$F[0];print "$hash{$F[0]}\t$F[1]" if exists $hash{$F[0]}}' >human.all.go.ensembl

在我的群里面共享了所有的代码及帖子内容，欢迎加群201161227，生信菜鸟团！

http://www.bio-info-trainee.com/?p=1

线下交流-生物信息学
同时欢迎下载使用我的手机安卓APP

http://www.cutt.com/app/down/840375

下载安装该软件：  wget https://codeload.github.com/TransDecoder/TransDecoder/tar.gz/2.0.1

解压进入该目录，查看里面的文件

make一下就可以用了，看起来好像是依赖于perl模块的

这个TransDecoder.LongOrfs就是我们这次需要的程序，查看该程序，的确真是一个perl程序，看来perl还是蛮有用的。

二：准备数据

它里面有个测试数据，是比较全面的，也比较复杂，我就不贴出来了，反正我是那trinity组装好的fasta格式的转录组数据来预测ORF的。

三：运行命令

它给的测试命令也很复杂

## generate alignment gff3 formatted output

../util/cufflinks_gtf_to_alignment_gff3.pl transcripts.gtf > transcripts.gff3

## generate transcripts fasta file

../util/cufflinks_gtf_genome_to_cdna_fasta.pl transcripts.gtf test.genome.fasta > transcripts.fasta 

## Extract the long ORFs

../TransDecoder.LongOrfs -t transcripts.fasta

当然我们只需要看最后一步，这是重点

我这里是直接对我们的trinity组装好的转录本进行预测ORF

/home/jmzeng/bio-soft/TransDecoder/TransDecoder.LongOrfs  -t Trinity.fasta

命令很简单

输出来的文件就有预测的蛋白文件，这个文件是trinotate对转录本进行注释所必须的文件

四：输出文件解读

longest_orfs.cds  这个是预测到的cds碱基序列，

longest_orfs.gff3  这个是预测得到的gff文件

longest_orfs.pep   这个就是预测得到的蛋白文件