hgu133plus2芯片数据太常见了，可以从GEO里面下载该study的原始测序数据，然后用affy,limma包来分析，也可以直接用GEOquery包来下载作者分析好的表达矩阵，然后直接做差异分析。我这里选择的是后者，而且我跟作者分析方法有一点区别是，我先把探针都注释好了基因，然后对每个基因只挑最大表达量的基因。而作者是直接对探针为单位的的表达矩阵进行差异分析，对分析结果里面的探针进行基因注释。我这里无法给出哪种方法好的绝对评价。代码如下：

rm(list=ls())
library(GEOquery)
library(limma)
GSE60291 <- getGEO('GSE60291', destdir=".",getGPL = F)

#下面是表达矩阵
exprSet=exprs(GSE60291[[1]])
library("annotate")
GSE60291[[1]]
## 下面是分组信息
pdata=pData(GSE60291[[1]])
treatment=factor(unlist(lapply(pdata$title,function(x) strsplit(as.character(x),"-")[[1]][1])))
#treatment=relevel(treatment,'control')
## 下面做基因注释
platformDB='hgu133plus2.db'
library(platformDB, character.only=TRUE)
probeset <- featureNames(GSE60291[[1]])
#EGID <- as.numeric(lookUp(probeset, platformDB, "ENTREZID"))
SYMBOL <-  lookUp(probeset, platformDB, "SYMBOL")
## 下面对每个基因挑选最大表达量探针
a=cbind(SYMBOL,exprSet)
## remove the duplicated probeset
rmDupID <-function(a=matrix(c(1,1:5,2,2:6,2,3:7),ncol=6)){
exprSet=a[,-1]
rowMeans=apply(exprSet,1,function(x) mean(as.numeric(x),na.rm=T))
a=a[order(rowMeans,decreasing=T),]
exprSet=a[!duplicated(a[,1]),]
#
exprSet=exprSet[!is.na(exprSet[,1]),]
rownames(exprSet)=exprSet[,1]
exprSet=exprSet[,-1]
return(exprSet)
}
exprSet=rmDupID(a)
rn=rownames(exprSet)
exprSet=apply(exprSet,2,as.numeric)
rownames(exprSet)=rn
exprSet[1:4,1:4]
#exprSet=log(exprSet) ## based on e
boxplot(exprSet,las=2)
## 下面用limma包来进行芯片数据差异分析
design=model.matrix(~ treatment)
fit=lmFit(exprSet,design)
fit=eBayes(fit)
#vennDiagram(decideTests(fit))
DEG=topTable(fit,coef=2,n=Inf,adjust='BH')
dim(DEG[abs(DEG[,1])>1.2 & DEG[,5]<0.05,])  ## 806 genes
write.csv(DEG,"ET1-normal.DEG.csv")

得到的ET1-normal.DEG.csv 文件就是我们的差异分析结果，可以跟文章提供的差异结果做比较，是几乎一模一样的！

如果根据logFC 1.2 p 矫正P 值0.05来挑选，可以拿到806个基因。

GSM1470353: control-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq   SRR1542714

GSM1470354: ET1-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq  SRR1542715

GSM1470355: control-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-SeqSRR1542716

GSM1470356: ET1-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542717

GSM1470357: control-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542718

GSM1470358: ET1-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542719

可以看到是6个样本的测序数据，分成两组，就是ET1刺激了CM细胞系前后对比而已！

### step8: differential expression analysis by R package for miRNA expression patterns:
## 文章里面提到的结果是：
MicroRNA sequencing revealed over 250 known and 34 predicted novel miRNAs to be differentially expressed between ET-1 stimulated and unstimulated control hiPSC-CMs.
## (FDR < 0.1 and 1.5 fold change)
rm(list=ls())
setwd('J:\\miRNA_test\\paper_results')  ##把从GEO里面下载的文献结果放在这里
sampleIDs=c()
groupList=c()
allFiles=list.files(pattern = '.txt')
i=allFiles[1]
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
dat=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(dat)=c('miRNA',sampleID)
groupList=c(groupList,treat)
for (i in allFiles[-1]){
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
a=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(a)=c('miRNA',sampleID)
dat=merge(dat,a,by='miRNA')
groupList=c(groupList,treat)
}

### 上面的代码只是为了把6个独立的表达文件给合并成一个表达矩阵
## we need to filter the low expression level miRNA
exprSet=dat[,-1]
rownames(exprSet)=dat[,1]
suppressMessages(library(DESeq2))
exprSet=ceiling(exprSet)
(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), groupList=groupList))

## DESeq2就是这么简单的用
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~ groupList)
dds <- DESeq(dds)
png("qc_dispersions.png", 1000, 1000, pointsize=20)
plotDispEsts(dds, main="Dispersion plot")
dev.off()
res <- results(dds)
## 画一些图，相当于做QC吧
png("RAWvsNORM.png")
rld <- rlogTransformation(dds)
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet,  col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet[,1])
hist(exprSet_new[,1])
dev.off()library(RColorBrewer)
(mycols <- brewer.pal(8, "Dark2")[1:length(unique(groupList))])

# Sample distance heatmap
sampleDists <- as.matrix(dist(t(exprSet_new)))
#install.packages("gplots",repos = "http://cran.us.r-project.org")
library(gplots)
png("qc-heatmap-samples.png", w=1000, h=1000, pointsize=20)
heatmap.2(as.matrix(sampleDists), key=F, trace="none",
col=colorpanel(100, "black", "white"),
ColSideColors=mycols[groupList], RowSideColors=mycols[groupList],
margin=c(10, 10), main="Sample Distance Matrix")
dev.off()

png("MA.png")
DESeq2::plotMA(res, main="DESeq2", ylim=c(-2,2))
dev.off()
## 重点就是这里啦，得到了差异分析的结果
resOrdered <- res[order(res$padj),]
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
write.csv(resOrdered,"deseq2.results.csv",quote = F)

##下面也是一些图，主要是看看样本之间的差异情况
library(limma)
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1))
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1) - log(t( t(assays(dds)[["mu"]]) / sizeFactors(dds) ) + 1))
plotMDS( assays(dds)[["counts"]] )  ## raw count
plotMDS( assays(dds)[["mu"]] ) ##- fitted values.

本来搞差异分析的工具和包就一大堆了，而且limma那个包已经非常完善了，我是不准备再讲这个的，正好有个同学问了一下这个包，我就随手测试了一下，顺便看看它跟limma有什么差异没有！手痒了就记录了测试流程！

学习一个包其实非常简单，就是找到包的官网看看说明书即可！说明书链接

 

samr这个包更简单，就一个函数SAM,但是根据分析数据的不同被包装成了两个函数，分别是处理高通量测序数据的SAMseq和处理芯片数据的samr,本次我只讲解芯片数据的处理，然后跟limma这个包做一个简单比较~

所以，我们只需要制作好数据，然后学会用samr这个函数即可！

我们还是利用CLL这个包的测试数据来讲解这个包的用法，首先也是制作表达矩阵和分组信息。

suppressPackageStartupMessages(library(CLL))
data(sCLLex)
exprSet=exprs(sCLLex)   ##sCLLex是依赖于CLL这个package的一个对象
samples=sampleNames(sCLLex)
pdata=pData(sCLLex)
group_list=as.character(pdata[,2])
group_list

##  [1] "progres." "stable"   "progres." "progres." "progres." "progres."
##  [7] "stable"   "stable"   "progres." "stable"   "progres." "stable"  
## [13] "progres." "stable"   "stable"   "progres." "progres." "progres."
## [19] "progres." "progres." "progres." "stable"

as.numeric(as.factor(group_list))

##  [1] 1 2 1 1 1 1 2 2 1 2 1 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 2

这个表达矩阵exprSet和分组信息group_list就可以直接用来做差异分析啦~！ 它的分组信息要求比较读取，需要1,1,1,2,2,2这样的向量，所以我用了as.numeric(as.factor(group_list))，具体见下面的代码！

suppressPackageStartupMessages(library(samr))
data=list(x=exprSet,y=as.numeric(as.factor(group_list)), 
          geneid=as.character(1:nrow(exprSet)),
          genenames=rownames(exprSet), 
          logged2=TRUE
)
samr.obj<-samr(data, resp.type="Two class unpaired", nperms=100)

这样其实已经OK啦，重点是如何调整这个函数的参数，以及如何理解这个函数返回的结果(samr.obj这个对象非常重要，关乎你能否真正用好samr)~

我这里的genenames其实是探针名，如果真正要做分析，可以修改，而且我的nperms次数为100，也可以修改，一般是1000.

除了直接应用它找差异基因外，它还有几个单独的函数

首先是对表达矩阵进行normalization

x.norm <- samr.norm.data(data$x)
par(mfrow=c(1,2))
boxplot(exprSet, col = rainbow(exprSet),main="before normalization",las=2)
boxplot(x.norm,  col = rainbow(exprSet),main="after normalization",las=2)

看图好像没什么区别

另外几个函数，我就不一一介绍了，大家可以自行探索。

* samr.plot(samr.obj, del, min.foldchange=0)

* samr.plot(samr.obj, del=.3)

* samr.assess.samplesize.obj<- samr.assess.samplesize(samr.obj, data, log2(1.5))

* samr.assess.samplesize.plot(samr.assess.samplesize.obj)

我们重点看看这个samr得到的差异与limma的差异区别在哪里

## 首先提取samr做差异分析检验的p值
pv=samr.pvalues.from.perms(samr.obj$tt, samr.obj$ttstar)
## 然后提取limma包做差异分析检验的p值
library(limma) 
design=model.matrix(~factor(sCLLex$Disease))
fit=lmFit(sCLLex,design)
fit=eBayes(fit)
options(digits = 4)
DEG_limma=topTable(fit,coef=2,adjust='BH',n=Inf) 
pv_limma=DEG_limma$P.Value
names(pv_limma)=rownames(DEG_limma)
head(pv[sort(names(pv))])

##  100_g_at   1000_at   1001_at 1002_f_at 1003_s_at   1004_at 
##    0.2531    0.4144    0.5671    0.5686    0.4687    0.6340

head(pv_limma[sort(names(pv_limma))])

##  100_g_at   1000_at   1001_at 1002_f_at 1003_s_at   1004_at 
##    0.2497    0.4312    0.5349    0.5498    0.4361    0.6473

cor(pv[sort(names(pv))],pv_limma[sort(names(pv_limma))])

## [1] 0.9976

从数据上来看，没什么本质区别,而且相关系数高达0.9978.

所以结论是，没必要搞那么多的包，用limma就好了，甚至直接用t检验也是OK的

还有plot和summary也是可以直接作用于samr的结果samr.obj对象的

现在又可以支持RNA-seq数据，我赶紧试用了一下!

我下面只讲用法，大家看代码就明白了！

##
library(limma)
library(pasilla)
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes)
group_list=pasillaGenes$condition
## 只需自己构造好表达矩阵exprSet和分因子即可group_list，一般只分成两组！！！
##一般是自己读取RNA-seq的基因的reads的counts数进行分析，

##请不要用RPKM等经过了normlization的表达矩阵来分析。
suppressMessages(library(limma))
design <- model.matrix(~factor(group_list))
colnames(design)=levels(factor(group_list))
rownames(design)=colnames(exprSet)
v <- voom(exprSet,design,normalize="quantile") ##这个是重点
## 到这里就跟limma本身的用法一样了！
fit <- lmFit(v,design)
fit2 <- eBayes(fit)
tempOutput = topTable(fit2, coef=2, n=Inf)
DEG_voom = na.omit(tempOutput)
head(DEG_voom)

它也是用了一种统计方法，把RNA-seq的基因的reads的counts数进行了normlization

正好准备筹集bioconductor中文社区，我写简单讲一下DESeq2这个包如何用！

library(DESeq2)
library(limma)
library(pasilla)
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes)  ##做好表达矩阵
group_list=pasillaGenes$condition##做好分组因子即可

(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), group_list=group_list))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~ group_list)

##上面是第一步第一步，构建dds这个对象，需要一个表达矩阵和分组矩阵！！！

dds2 <- DESeq(dds)  ##第二步，直接用DESeq函数即可

resultsNames(dds2)

res <-  results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))

## 提取你想要的差异分析结果，我们这里是treated组对untreated组进行比较

resOrdered <- res[order(res$padj),]

resOrdered=as.data.frame(resOrdered)

可以看到程序非常好用！

它只对RNA-seq的基因的reads的counts数进行分析，请不要用RPKM等经过了normlization的表达矩阵来分析。

值得一提的是DESeq2软件独有的normlization方法！

rld <- rlogTransformation(dds2)  ## 得到经过DESeq2软件normlization的表达矩阵！
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet)
hist(exprSet_new)

看这个图就知道了，它把本来应该是数据离散程度非常大的RNA-seq的基因的reads的counts矩阵经过normlization后变成了类似于芯片表达数据的表达矩阵，然后其实可以直接用T检验来找差异基因了！

但是，如果你的分组不只是两个，就复杂了，你需要再仔细研读说明书，甚至你可能需要咨询实验设计人员或者统计人员！

最流行的差异分析软件就是limma了，它现在更新了一个voom的算法，所以既可以对芯片数据，也可以对转录组高通量测序数据进行分析，其它所有的差异分析软件其实都是模仿这个的。

我以前讲到过做差异分析，需要三个数据：

• 表达矩阵
• 分组矩阵
• 差异比较矩阵

前面两个肯定是必须的，有表达矩阵，样本必须进行分组，才能分析，但是我看到过好几种例子，有的有差异比较矩阵，有的没有。

后来我仔细研究了一下limma包的说明书，发现这其实是一个很简单的问题。

大家仔细观察下面的两个代码

首先是不需要差异比较矩阵的

然后是需要差异比较矩阵的

大家运行一下这些代码就知道，两者结果是一模一样的。

而差异比较矩阵的需要与否，主要看分组矩阵如何制作的！

design=model.matrix(~factor(sCLLex$Disease))

design=model.matrix(~0+factor(sCLLex$Disease))

有本质的区别！！！

前面那种方法已经把需要比较的组做出到了一列，需要比较多次，就有多少列，第一列是截距不需要考虑，第二列开始往后用coef这个参数可以把差异分析结果一个个提取出来。

而后面那种方法，仅仅是分组而已，组之间需要如何比较，需要自己再制作差异比较矩阵，通过makeContrasts函数来控制如何比较！

那么最后计算得到的logFC这一列的值，其实就是输入的表达矩阵中case一组的平均表达量减去control一组的平均表达量的值，那么就会有正负之分，代表了case相当于control组来说，该基因是上调还是下调。

我之前总是有疑问，明明是case一组的平均表达量和control一组的平均表达量差值呀，跟log foldchange没有什么关系呀。

后来，我终于想通了，因为我们输入的是log后的表达矩阵，那么case一组的平均表达量和control一组的平均表达量都是log了的，那么它们的差值其实就是log的foldchange

首先，我们要理解foldchange的意义，如果case是平均表达量是8，control是2，那么foldchange就是4，logFC就是2咯

那么在limma包里面，输入的时候case的平均表达量被log后是3，control是1，那么差值是2，就是说logFC就是2。

这不是巧合，只是一个很简单的数学公式log(x/y)=log(x)-log(y)

首先，还是得到表达矩阵，下面绿色的样本是NASH组，蓝色的样本是normal组

我们进行差异分析，很简单，就是看两组的表达值，是否差异，而检验的方法就是T检验。

=AVERAGE(D2:L2)    ##求NASH组的平均表达量

=AVERAGE(M2:S2)    ###求normal的平均表达量

=T2-U2             ##计算得到logFOLDchange值

=AVERAGE(D2:S2)    ###得到所有样本的平均表达量

=T.TEST(D2:L2,M2:T2,2,3)  ###用T检验得到两个组的表达量的差异显著程度。

简单检查几个值就可以看到跟limma包得到的结果差不多。

首先做第一个数据，基因表达矩阵！

自己在NCBI里面可以查到下载地址，然后用R语言读取即可

exprSet=read.table("GSE63067_series_matrix.txt.gz",comment.char = "!",stringsAsFactors=F,header=T)

rownames(exprSet)=exprSet[,1]

exprSet=exprSet[,-1]

然后做好分组矩阵，如下

然后做好，差异比较矩阵，就是说明你想把那些组拿起来做差异分析，如下

最后输出结果：

我进行了6次比较，所以会输出6次比较结果

最后打开差异结果，解读，说明书如下！

忒

在我的github有完整代码