把得到的差异miRNA的表达量画一个热图，看看它是否能显著的分类
用miRWalk2.0等数据库或者根据来获取这些差异miRNA的validated target genes
然后看看这些pairs of miRNA- target genes的表达量相关系数，选取显著正相关或者负相关的pairs
这些被选取的pairs of miRNA- target genes拿去做富集分析
最后这些pairs of miRNA- target genes做PPI网络分析

首先我们看第一个热图的实现：

resOrdered=na.omit(resOrdered)
DEmiRNA=resOrdered[abs(resOrdered$log2FoldChange)>log2(1.5) & resOrdered$padj <0.01 ,]
write.csv(resOrdered,"deseq2.results.csv",quote = F)
DEmiRNAexprSet=exprSet[rownames(DEmiRNA),]
write.csv(DEmiRNAexprSet,'DEmiRNAexprSet.csv')

DEmiRNAexprSet=read.csv('DEmiRNAexprSet.csv',stringsAsFactors = F)
exprSet=as.matrix(DEmiRNAexprSet[,2:7])
rownames(exprSet)=rownames(DEmiRNAexprSet)
heatmap(exprSet)
gplots::heatmap.2(exprSet)
library(pheatmap)
## http://biit.cs.ut.ee/clustvis/

因为我前面保存的表达量就基于counts的，所以画热图还需要进行normalization，我这里懒得弄了，就用了一个网页版工具，自动出热图http://biit.cs.ut.ee/clustvis/

感觉还不错，可以很清楚的看到ET1刺激前后细胞中miRNA表达量变化

然后就是检验我们选取的感兴趣的有显著差异的miRNA的target genes，这时候有两种方法，一个是先由数据库得到已经被检验的miRNA的target genes，另一种是根据miRNA和mRNA表达量的相关性来预测。

用数据库来查找MiRNA的作用基因，非常多的工具，比较常用的有TargetScan/miRTarBase
### http://nar.oxfordjournals.org/content/early/2015/11/19/nar.gkv1258.full
### http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/
### http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/cache/download/6.1/hsa_MTI.xlsx
### http://www.targetscan.org/vert_71/ (version 7.1 (June 2016))
我还看到过一个整合工具： miRecords  (DIANA-microT, MicroInspector, miRanda, MirTarget2, miTarget, NBmiRTar, PicTar, PITA, RNA22, RNAhybrid and TargetScan/TargertScanS)里面提到了查找MiRNA的作用基因这一过程，高假阳性，至少被5种工具支持，才算是真的
还有很多类似的工具，miRWalk2，psRNATarget网页版工具，最后值得一提的是中山大学的： starBase  Pan-Cancer Analysis Platform is designed for deciphering Pan-Cancer Networks of lncRNAs, miRNAs, ceRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) by mining clinical and expression profiles of 14 cancer types (>6000 samples) from The Cancer Genome Atlas (TCGA) Data Portal (all data available without limitations).虽然我没有仔细的用，但是看介绍好牛的样子，还有一个R包：miRLAB我玩了一会，它是先通过算所有配对的miRNA- genes的表达量相关系数，选取显著正相关或者负相关的pairs，然后反过来通过已知数据库来验证。

后面我就不讲了，主要看你得到miRNA的时候其它生物学数据是否充分，如果是癌症病人，有生存相关数据，可以做生存分析，如果你同时测了甲基化数据，可以做甲基化相关分析~~~~~~~~~

如果只是单纯的miRNA测序数据，可以回过头去研究一下de novo的miRNA预测的步骤，也是研究重点

hgu133plus2芯片数据太常见了，可以从GEO里面下载该study的原始测序数据，然后用affy,limma包来分析，也可以直接用GEOquery包来下载作者分析好的表达矩阵，然后直接做差异分析。我这里选择的是后者，而且我跟作者分析方法有一点区别是，我先把探针都注释好了基因，然后对每个基因只挑最大表达量的基因。而作者是直接对探针为单位的的表达矩阵进行差异分析，对分析结果里面的探针进行基因注释。我这里无法给出哪种方法好的绝对评价。代码如下：

rm(list=ls())
library(GEOquery)
library(limma)
GSE60291 <- getGEO('GSE60291', destdir=".",getGPL = F)

#下面是表达矩阵
exprSet=exprs(GSE60291[[1]])
library("annotate")
GSE60291[[1]]
## 下面是分组信息
pdata=pData(GSE60291[[1]])
treatment=factor(unlist(lapply(pdata$title,function(x) strsplit(as.character(x),"-")[[1]][1])))
#treatment=relevel(treatment,'control')
## 下面做基因注释
platformDB='hgu133plus2.db'
library(platformDB, character.only=TRUE)
probeset <- featureNames(GSE60291[[1]])
#EGID <- as.numeric(lookUp(probeset, platformDB, "ENTREZID"))
SYMBOL <-  lookUp(probeset, platformDB, "SYMBOL")
## 下面对每个基因挑选最大表达量探针
a=cbind(SYMBOL,exprSet)
## remove the duplicated probeset
rmDupID <-function(a=matrix(c(1,1:5,2,2:6,2,3:7),ncol=6)){
exprSet=a[,-1]
rowMeans=apply(exprSet,1,function(x) mean(as.numeric(x),na.rm=T))
a=a[order(rowMeans,decreasing=T),]
exprSet=a[!duplicated(a[,1]),]
#
exprSet=exprSet[!is.na(exprSet[,1]),]
rownames(exprSet)=exprSet[,1]
exprSet=exprSet[,-1]
return(exprSet)
}
exprSet=rmDupID(a)
rn=rownames(exprSet)
exprSet=apply(exprSet,2,as.numeric)
rownames(exprSet)=rn
exprSet[1:4,1:4]
#exprSet=log(exprSet) ## based on e
boxplot(exprSet,las=2)
## 下面用limma包来进行芯片数据差异分析
design=model.matrix(~ treatment)
fit=lmFit(exprSet,design)
fit=eBayes(fit)
#vennDiagram(decideTests(fit))
DEG=topTable(fit,coef=2,n=Inf,adjust='BH')
dim(DEG[abs(DEG[,1])>1.2 & DEG[,5]<0.05,])  ## 806 genes
write.csv(DEG,"ET1-normal.DEG.csv")

得到的ET1-normal.DEG.csv 文件就是我们的差异分析结果，可以跟文章提供的差异结果做比较，是几乎一模一样的！

如果根据logFC 1.2 p 矫正P 值0.05来挑选，可以拿到806个基因。

GSM1470353: control-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq   SRR1542714

GSM1470354: ET1-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq  SRR1542715

GSM1470355: control-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-SeqSRR1542716

GSM1470356: ET1-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542717

GSM1470357: control-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542718

GSM1470358: ET1-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542719

可以看到是6个样本的测序数据，分成两组，就是ET1刺激了CM细胞系前后对比而已！

### step8: differential expression analysis by R package for miRNA expression patterns:
## 文章里面提到的结果是：
MicroRNA sequencing revealed over 250 known and 34 predicted novel miRNAs to be differentially expressed between ET-1 stimulated and unstimulated control hiPSC-CMs.
## (FDR < 0.1 and 1.5 fold change)
rm(list=ls())
setwd('J:\\miRNA_test\\paper_results')  ##把从GEO里面下载的文献结果放在这里
sampleIDs=c()
groupList=c()
allFiles=list.files(pattern = '.txt')
i=allFiles[1]
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
dat=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(dat)=c('miRNA',sampleID)
groupList=c(groupList,treat)
for (i in allFiles[-1]){
sampleID=strsplit(i,"_")[[1]][1]
treat=strsplit(i,"_")[[1]][4]
a=read.table(i,stringsAsFactors = F)
colnames(a)=c('miRNA',sampleID)
dat=merge(dat,a,by='miRNA')
groupList=c(groupList,treat)
}

### 上面的代码只是为了把6个独立的表达文件给合并成一个表达矩阵
## we need to filter the low expression level miRNA
exprSet=dat[,-1]
rownames(exprSet)=dat[,1]
suppressMessages(library(DESeq2))
exprSet=ceiling(exprSet)
(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), groupList=groupList))

## DESeq2就是这么简单的用
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,
design = ~ groupList)
dds <- DESeq(dds)
png("qc_dispersions.png", 1000, 1000, pointsize=20)
plotDispEsts(dds, main="Dispersion plot")
dev.off()
res <- results(dds)
## 画一些图，相当于做QC吧
png("RAWvsNORM.png")
rld <- rlogTransformation(dds)
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)
n.sample=ncol(exprSet)
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet,  col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet[,1])
hist(exprSet_new[,1])
dev.off()library(RColorBrewer)
(mycols <- brewer.pal(8, "Dark2")[1:length(unique(groupList))])

# Sample distance heatmap
sampleDists <- as.matrix(dist(t(exprSet_new)))
#install.packages("gplots",repos = "http://cran.us.r-project.org")
library(gplots)
png("qc-heatmap-samples.png", w=1000, h=1000, pointsize=20)
heatmap.2(as.matrix(sampleDists), key=F, trace="none",
col=colorpanel(100, "black", "white"),
ColSideColors=mycols[groupList], RowSideColors=mycols[groupList],
margin=c(10, 10), main="Sample Distance Matrix")
dev.off()

png("MA.png")
DESeq2::plotMA(res, main="DESeq2", ylim=c(-2,2))
dev.off()
## 重点就是这里啦，得到了差异分析的结果
resOrdered <- res[order(res$padj),]
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
write.csv(resOrdered,"deseq2.results.csv",quote = F)

##下面也是一些图，主要是看看样本之间的差异情况
library(limma)
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1))
plotMDS(log(counts(dds, normalized=TRUE) + 1) - log(t( t(assays(dds)[["mu"]]) / sizeFactors(dds) ) + 1))
plotMDS( assays(dds)[["counts"]] )  ## raw count
plotMDS( assays(dds)[["mu"]] ) ##- fitted values.

## step6: counts the reads which mapping to each miRNA reference.

## we need to exclude unmapped as well as multiple-mapped  reads

## XS:i:<n> Alignment score for second-best alignment. Can be negative. Can be greater than 0 in --local mode

## NM:i:1   ## NM i Edit distance to the reference, including ambiguous bases but excluding clipping

#The following command exclude unmapped (-F 4) as well as multiple-mapped (grep -v “XS:”) reads

#samtools view -F 4 input.bam | grep -v "XS:" | wc -l

## 180466//1520320

##cat >count.hairpin.sh

ls *hairpin.sam  | while read id

do

samtools view  -SF 4 $id |perl -alne '{$h{$F[2]}++}END{print "$_\t$h{$_}" foreach sort keys %h }'  > ${id%%_*}.hairpin.counts

done

## bash count.hairpin.sh

##cat >count.mature.sh

ls *mature.sam  | while read id

do

samtools view  -SF 4 $id |perl -alne '{$h{$F[2]}++}END{print "$_\t$h{$_}" foreach sort keys %h }'  > ${id%%_*}.mature.counts

done

## bash count.mature.sh

### step7: compare the results with paper's

GSM1470353: control-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq   SRR1542714

GSM1470354: ET1-CM, experiment1; Homo sapiens; miRNA-Seq  SRR1542715

GSM1470355: control-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-SeqSRR1542716

GSM1470356: ET1-CM, experiment2; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542717

GSM1470357: control-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542718

GSM1470358: ET1-CM, experiment3; Homo sapiens; miRNA-Seq SRR1542719

### 下面我用R语言来检验一下，我得到的分析结果跟文章发表的结果的区别。

 a=read.table("bowtie_bam/SRR1542714.mature.counts")

 b=read.table("paper_results/GSM1470353_iPS_010313_Unstim_known_miRNA_counts.txt")

 plot(log(tmp[,2]),log(tmp[,3]))

 cor(tmp[,2],tmp[,3])

##[1] 0.8413439

本文选择的是SHRiMP这个小众软件，起初我并没有在意，就用的bowtie2而已，参考基因组我这里因为服务器原因，就用了miRBase数据库下载的人类的参考序列，现在的miRNA版本来说，人类这个物种已知的成熟miRNA共有2588条序列，而前体miRNA共有1881条序列，我下载（下载时间2016年6月 ）的代码见 自学miRNA-seq分析第二讲~学习资料的搜集 ，下面比对所用到的软件已经序列在我的： 自学miRNA-seq分析第三讲~公共测序数据下载

## step5 : alignment to miRBase v21 (hairpin.human.fa/mature.human.fa )

#### step5.1 using bowtie2 to do alignment

mkdir  bowtie2_index &&  cd bowtie2_index

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2-build ../hairpin.human.fa hairpin_human

~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2-build ../mature.human.fa  mature_human

ls *_clean.fq.gz | while read id ; do  ~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -x miRBase/bowtie2_index/hairpin_human -U $id   -S ${id%%.*}.hairpin.sam ; done

## overall alignment rate:  10.20% / 5.71%/ 10.18%/ 4.36% / 10.02% / 4.95%  (before convert U to T )

## overall alignment rate:  51.77% / 70.38%/51.45% /61.14%/ 52.20% / 65.85% (after convert U to T )

ls *_clean.fq.gz | while read id ; do  ~/biosoft/bowtie/bowtie2-2.2.9/bowtie2 -x miRBase/bowtie2_index/mature_human  -U $id   -S ${id%%.*}.mature.sam ; done

## overall alignment rate:  6.67% / 3.78% / 6.70% / 2.80%/ 6.55% / 3.23%    (before convert U to T )

## overall alignment rate:  34.94% / 46.16%/ 35.00%/ 38.50% / 35.46% /42.41%(after convert U to T )

#### step5.2 using SHRiMP to do alignment

##    http://compbio.cs.toronto.edu/shrimp/README

##    3.5 Mapping cDNA reads against a miRNA database

cd ~/biosoft/SHRiMP/SHRiMP_2_2_3

export SHRIMP_FOLDER=$PWD

cd -

##　　We project the database with:

$SHRIMP_FOLDER/utils/project-db.py --seed 00111111001111111100,00111111110011111100,00111111111100111100,00111111111111001100,00111111111111110000 \

 --h-flag --shrimp-mode ls miRBase/hairpin.human.fa

##

$SHRIMP_FOLDER/bin/gmapper-ls -L  hairpin.human-ls SRR1542716.fastq  --qv-offset 33   \

-o 1 -H -E -a -1 -q -30 -g -30 --qv-offset 33 --strata -N 8  >map.out 2>map.log

大家可以看到我们把测序reads比对到前体miRNA和成熟的miRNA结果是有略微区别的，因为一个前体miRNA可以形成多个成熟的miRNA，而并不是所有的成熟的miRNA形式都被记录在数据库，所以一般推荐我们比对到前体miRNA数据库，这样还可以预测新的成熟miRNA，也是非常有意义的。

而且有个非常重要的一点，就是大家可以看到我把U变成T前后比对率差异非常大，这其实是一个非常蠢的错误。我就不多说了。但是做到这一步，其实可以跟文章来做验证了，文章有提到比对率，比对的序列。

我也是在博客里面看到这个信息的：

Thank you so  much!. Yes I contacted the lab-guy and he just said that trimmed the first 4 bp and last 4bp. ( as you found)

So  I firstly trimmed the adapter sequences(TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC)

And then, trimmed the first 4bp and last 4bp from reads, which leads to the 22bp peak of read-length distribution(instead of 24bp)

Anyhow, I tried to map with bowtie2 again.

> bowtie2 --local -N 1 -L 16

-x ../miRNA_reference/hairpin_UtoT.fa

-U first4bptrimmed_A1-SmallRNA_S1_L001_R1_001_Illuminaadpatertrim.fastq

-S f4_trimmed.sam

I also changed hairpin.fa file (U to T) 

Oh.. thank you David,

Finallly, I got

2565353 reads; of these:
2565353 (100.00%) were unpaired; of these:
479292 (18.68%) aligned 0 times
11959 (0.47%) aligned exactly 1 time
2074102 (80.85%) aligned >1 times
81.32% overall alignment rate

下面是我用新服务器下载安装软件的一些代码记录，因为fastx_toolkit /fastqc我已经安装过，就不列代码了，还有miRBase的下载，我在前面第二讲里面提到过，传送门：自学miRNA-seq分析第二讲~学习资料的搜集

## pre-step: download sratoolkit /fastx_toolkit_0.0.13/fastqc/bowtie2/hg19/miRBase/SHRiMP

## http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/sra.cgi?view=software

## http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK158900/

 ## 我这里特意挑选的二进制版本程序下载的，这样直接解压就可以用，但是需要挑选适合自己的操作系统的程序。

cd ~/biosoft

mkdir sratoolkit &&  cd sratoolkit

wget http://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/2.6.3/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64.tar.gz

##

##  Length: 63453761 (61M) [application/x-gzip]

##  Saving to: "sratoolkit.2.6.3-centos_linux64.tar.gz"

tar zxvf sratoolkit.2.6.3-centos_linux64.tar.gz

cd ~/biosoft

mkdir bowtie &&  cd bowtie

wget https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie2/2.2.9/bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip/download

#Length: 27073243 (26M) [application/octet-stream]

#Saving to: "download"

 mv download  bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip

 unzip bowtie2-2.2.9-linux-x86_64.zip

## http://compbio.cs.toronto.edu/shrimp/

mkdir SHRiMP &&  cd SHRiMP

wget http://compbio.cs.toronto.edu/shrimp/releases/SHRiMP_2_2_3.lx26.x86_64.tar.gz

tar zxvf SHRiMP_2_2_3.lx26.x86_64.tar.gz 

cd SHRiMP_2_2_3

export SHRIMP_FOLDER=$PWD  ## 这个软件使用的时候比较奇葩，需要设置到环境变量，不能简单的调用全路径

我首先拿到了miRNA定义：http://nar.oxfordjournals.org/content/34/suppl_1/D135.full ，当然基本上每个研究miRNA的文章都会在前言里面写到这个，我只是随意列出一个而已。

MicroRNAs (miRNAs) are small RNA molecules, which are ∼22 nt sequences that have an important role in the translational regulation and degradation of mRNA by the base's pairing to the 3′-untranslated regions (3′-UTR) of the mRNAs. The miRNAs are derived from the precursor transcripts of ∼70–120 nt sequences, which fold to form as stem–loop structures, which are thought to be highly conserved in the evolution of genomes. Previous analyses have suggested that ∼1% of all human genes are miRNA genes, which regulate the production of protein for 10% or more of all human coding genes。

然后我比较纠结的问题是参考序列如何选择，因为miRNA序列很少，把它map到3G大小的人类基因组有点浪费计算资源，正好我的服务器又坏了，不想太麻烦，想用自己的个人电脑搞定这个学习过程。我看到很多帖子提到的都是比对到参考miRNA数据库(miRNA count: 28645 entries)，用bowtie ：  http://www.mirbase.org/ ，从这个数据库，我明白了前体miRNA和成熟的miRNA的区别，前体miRNA长度一般是∼70–120 碱基，前体miRNA一般是茎环结果，也就是发夹结构，所以叫做hairpin。成熟之后，一般∼22 个碱基，在miRNA数据库很容易下载到这些数据，现在的miRNA版本来说，人类这个物种已知的成熟miRNA共有2588条序列，而前体miRNA共有1881条序列，我下载（下载时间2016年6月 ）的代码是：

 wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/hairpin.fa.gz   ##　28645　reads

 wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa.zip   ##   35828 reads 

 wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/hairpin.fa.zip

 wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/genomes/hsa.gff3 ##

 wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/miFam.dat.zip

 grep sapiens mature.fa |wc  　# 2588 

 grep sapiens hairpin.fa |wc       # 1881 

## Homo sapiens

perl -alne '{if(/^>/){if(/Homo/){$tmp=1}else{$tmp=0}};next if $tmp!=1;s/U/T/g if !/>/;print }' hairpin.fa >hairpin.human.fa

perl -alne '{if(/^>/){if(/Homo/){$tmp=1}else{$tmp=0}};next if $tmp!=1;s/U/T/g if !/>/;print }' mature.fa >mature.human.fa

这里值得一提的是miRBase数据库下载的序列，居然都是用U表示的，也就是说就是miRNA序列，而不是转录成该miRNA的基因序列，而我们测序的都是基因序列。

通过这个代码制作的 hairpin.human.fa 和 mature.human.fa 就是本次数据分析的参考基因组。

搜集资料的过程中，我看到了一篇文献讲挖掘1000genomes的数据找到位于miRNA的snp位点，https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/gm363 ，看起来比较新奇，不过跟本次学习过程没有关系，我就是记录一下，有空回来学习学习。

同时，我看到了一些博客讲解如何分析miRNA数据：http://genomespot.blogspot.com/2013/08/quick-alignment-of-microrna-seq-data-to.html

还有很多公司讲数据分析流程：

http://bioinfo5.ugr.es/miRanalyzer/miRanalyzer_tutorial.html

http://www.partek.com/sites/default/files/Assets/UserGuideMicroRNAPipeline.pdf

http://partek.com/Tutorials/microarray/microRNA/miRNA_tutorial.pdf

http://www.arraystar.com/reviews/microrna-sequencing-data-analysis-guideline/

http://bioinfo5.ugr.es/sRNAbench/sRNAbench_tutorial.pdf

http://seqcluster.readthedocs.io/mirna_annotation.html

耶鲁大学好像做得不错： http://www.yale.edu/giraldezlab/miRNA.html

中国有个南方基因： http://www.southgene.com/newsshow.php?cid=55&id=73

miRNA研究整套方案  http://wenku.baidu.com/view/5f38577a31b765ce05081429.html?re=view

Biostar 讨论帖子：

https://www.biostars.org/p/3344/

https://www.biostars.org/p/98486/

miRNA-seq数据处理实战指南：　http://bib.oxfordjournals.org/content/early/2015/04/17/bib.bbv019.full

直接用一个包也可以搞定：　http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/easyRNASeq.html

ｇｉｔｈｕｂ流程：miRNA Analysis Pipeline v0.2.7　　　https://github.com/bcgsc/mirna/tree/master/v0.2.7

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/CO25176_0512.pdf

miRNA annotation　　：　　http://seqcluster.readthedocs.io/mirna_annotation.html

开发的网页版分析工具：　https://wiki.uio.no/projects/clsi/images/2/2f/HTS_2014_miRNA_analysis_Lifeportal_14_final.pdf

Ｒ　ｐａｃｋａｇｅ　也很好用：　http://bioinf.wehi.edu.au/subread-package/SubreadUsersGuide.pdf

一个培训：　http://www.training.prace-ri.eu/uploads/tx_pracetmo/NGSdataAnalysisWithChipster.pdf

可视化IGV User Guide：　　http://www.broadinstitute.org/igv/book/export/html/6

比较特殊的是新的miRNA预测，miRNA靶基因预测，这块研究太多软件了，并没有成型的流程和标准。

这里选择的文章是2014年发表的，作者用ET-1刺激human iPSCs (hiPSC-CMs) 细胞前后，想看看 miRNA和mRNA表达量的变化，我并没有细看该文章的生物学意义，仅仅从数据分析的角度解读一下这篇文章，mRNA表达量用的是Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，分析起来特别容易，就是得到表达矩阵，然后用limma这个包找找差异表达基因即可。但是mRNA分析起来就有点麻烦了，作者用的是iron torrent测序仪，但是从SRA数据中心下载的是已经去掉接头的测序数据，fastq格式的，所以这里其实并不需要考虑测序仪的特异性。

关于该文章的几个资料收集如下：

## paper : http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0108051

## Aggarwal P, Turner A, Matter A, Kattman SJ et al. RNA expression profiling of human iPSC-derived cardiomyocytes in a cardiac hypertrophy model. PLoS One 2014;9(9):e108051. PMID: 25255322

## The accession numbers are 1. SuperSeries (mRNA+miRNA) - GSE60293

## 2. mRNA expression array - GSE60291  (Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)

## 3. miRNA-Seq - GSE60292  (Ion Torrent)

## GEO   : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE60292

## FTP   : ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP045/SRP045420