一般来说看链接最后的文件名就知道这篇文章讲的是什么了：

下面是一堆高通量测序分析的结题报告：

hgu133plus2芯片数据太常见了，可以从GEO里面下载该study的原始测序数据，然后用affy,limma包来分析，也可以直接用GEOquery包来下载作者分析好的表达矩阵，然后直接做差异分析。我这里选择的是后者，而且我跟作者分析方法有一点区别是，我先把探针都注释好了基因，然后对每个基因只挑最大表达量的基因。而作者是直接对探针为单位的的表达矩阵进行差异分析，对分析结果里面的探针进行基因注释。我这里无法给出哪种方法好的绝对评价。代码如下：

rm(list=ls())
library(GEOquery)
library(limma)
GSE60291 <- getGEO('GSE60291', destdir=".",getGPL = F)

#下面是表达矩阵
exprSet=exprs(GSE60291[[1]])
library("annotate")
GSE60291[[1]]
## 下面是分组信息
pdata=pData(GSE60291[[1]])
treatment=factor(unlist(lapply(pdata$title,function(x) strsplit(as.character(x),"-")[[1]][1])))
#treatment=relevel(treatment,'control')
## 下面做基因注释
platformDB='hgu133plus2.db'
library(platformDB, character.only=TRUE)
probeset <- featureNames(GSE60291[[1]])
#EGID <- as.numeric(lookUp(probeset, platformDB, "ENTREZID"))
SYMBOL <-  lookUp(probeset, platformDB, "SYMBOL")
## 下面对每个基因挑选最大表达量探针
a=cbind(SYMBOL,exprSet)
## remove the duplicated probeset
rmDupID <-function(a=matrix(c(1,1:5,2,2:6,2,3:7),ncol=6)){
exprSet=a[,-1]
rowMeans=apply(exprSet,1,function(x) mean(as.numeric(x),na.rm=T))
a=a[order(rowMeans,decreasing=T),]
exprSet=a[!duplicated(a[,1]),]
#
exprSet=exprSet[!is.na(exprSet[,1]),]
rownames(exprSet)=exprSet[,1]
exprSet=exprSet[,-1]
return(exprSet)
}
exprSet=rmDupID(a)
rn=rownames(exprSet)
exprSet=apply(exprSet,2,as.numeric)
rownames(exprSet)=rn
exprSet[1:4,1:4]
#exprSet=log(exprSet) ## based on e
boxplot(exprSet,las=2)
## 下面用limma包来进行芯片数据差异分析
design=model.matrix(~ treatment)
fit=lmFit(exprSet,design)
fit=eBayes(fit)
#vennDiagram(decideTests(fit))
DEG=topTable(fit,coef=2,n=Inf,adjust='BH')
dim(DEG[abs(DEG[,1])>1.2 & DEG[,5]<0.05,])  ## 806 genes
write.csv(DEG,"ET1-normal.DEG.csv")

得到的ET1-normal.DEG.csv 文件就是我们的差异分析结果，可以跟文章提供的差异结果做比较，是几乎一模一样的！

如果根据logFC 1.2 p 矫正P 值0.05来挑选，可以拿到806个基因。

本来搞差异分析的工具和包就一大堆了，而且limma那个包已经非常完善了，我是不准备再讲这个的，正好有个同学问了一下这个包，我就随手测试了一下，顺便看看它跟limma有什么差异没有！手痒了就记录了测试流程！

学习一个包其实非常简单，就是找到包的官网看看说明书即可！说明书链接

 

samr这个包更简单，就一个函数SAM,但是根据分析数据的不同被包装成了两个函数，分别是处理高通量测序数据的SAMseq和处理芯片数据的samr,本次我只讲解芯片数据的处理，然后跟limma这个包做一个简单比较~

所以，我们只需要制作好数据，然后学会用samr这个函数即可！

我们还是利用CLL这个包的测试数据来讲解这个包的用法，首先也是制作表达矩阵和分组信息。

suppressPackageStartupMessages(library(CLL))
data(sCLLex)
exprSet=exprs(sCLLex)   ##sCLLex是依赖于CLL这个package的一个对象
samples=sampleNames(sCLLex)
pdata=pData(sCLLex)
group_list=as.character(pdata[,2])
group_list

##  [1] "progres." "stable"   "progres." "progres." "progres." "progres."
##  [7] "stable"   "stable"   "progres." "stable"   "progres." "stable"  
## [13] "progres." "stable"   "stable"   "progres." "progres." "progres."
## [19] "progres." "progres." "progres." "stable"

as.numeric(as.factor(group_list))

##  [1] 1 2 1 1 1 1 2 2 1 2 1 2 1 2 2 1 1 1 1 1 1 2

这个表达矩阵exprSet和分组信息group_list就可以直接用来做差异分析啦~！ 它的分组信息要求比较读取，需要1,1,1,2,2,2这样的向量，所以我用了as.numeric(as.factor(group_list))，具体见下面的代码！

suppressPackageStartupMessages(library(samr))
data=list(x=exprSet,y=as.numeric(as.factor(group_list)), 
          geneid=as.character(1:nrow(exprSet)),
          genenames=rownames(exprSet), 
          logged2=TRUE
)
samr.obj<-samr(data, resp.type="Two class unpaired", nperms=100)

这样其实已经OK啦，重点是如何调整这个函数的参数，以及如何理解这个函数返回的结果(samr.obj这个对象非常重要，关乎你能否真正用好samr)~

我这里的genenames其实是探针名，如果真正要做分析，可以修改，而且我的nperms次数为100，也可以修改，一般是1000.

除了直接应用它找差异基因外，它还有几个单独的函数

首先是对表达矩阵进行normalization

x.norm <- samr.norm.data(data$x)
par(mfrow=c(1,2))
boxplot(exprSet, col = rainbow(exprSet),main="before normalization",las=2)
boxplot(x.norm,  col = rainbow(exprSet),main="after normalization",las=2)

看图好像没什么区别

另外几个函数，我就不一一介绍了，大家可以自行探索。

* samr.plot(samr.obj, del, min.foldchange=0)

* samr.plot(samr.obj, del=.3)

* samr.assess.samplesize.obj<- samr.assess.samplesize(samr.obj, data, log2(1.5))

* samr.assess.samplesize.plot(samr.assess.samplesize.obj)

我们重点看看这个samr得到的差异与limma的差异区别在哪里

## 首先提取samr做差异分析检验的p值
pv=samr.pvalues.from.perms(samr.obj$tt, samr.obj$ttstar)
## 然后提取limma包做差异分析检验的p值
library(limma) 
design=model.matrix(~factor(sCLLex$Disease))
fit=lmFit(sCLLex,design)
fit=eBayes(fit)
options(digits = 4)
DEG_limma=topTable(fit,coef=2,adjust='BH',n=Inf) 
pv_limma=DEG_limma$P.Value
names(pv_limma)=rownames(DEG_limma)
head(pv[sort(names(pv))])

##  100_g_at   1000_at   1001_at 1002_f_at 1003_s_at   1004_at 
##    0.2531    0.4144    0.5671    0.5686    0.4687    0.6340

head(pv_limma[sort(names(pv_limma))])

##  100_g_at   1000_at   1001_at 1002_f_at 1003_s_at   1004_at 
##    0.2497    0.4312    0.5349    0.5498    0.4361    0.6473

cor(pv[sort(names(pv))],pv_limma[sort(names(pv_limma))])

## [1] 0.9976

从数据上来看，没什么本质区别,而且相关系数高达0.9978.

所以结论是，没必要搞那么多的包，用limma就好了，甚至直接用t检验也是OK的

还有plot和summary也是可以直接作用于samr的结果samr.obj对象的

最流行的差异分析软件就是limma了，它现在更新了一个voom的算法，所以既可以对芯片数据，也可以对转录组高通量测序数据进行分析，其它所有的差异分析软件其实都是模仿这个的。

我以前讲到过做差异分析，需要三个数据：

• 表达矩阵
• 分组矩阵
• 差异比较矩阵

前面两个肯定是必须的，有表达矩阵，样本必须进行分组，才能分析，但是我看到过好几种例子，有的有差异比较矩阵，有的没有。

后来我仔细研究了一下limma包的说明书，发现这其实是一个很简单的问题。

大家仔细观察下面的两个代码

首先是不需要差异比较矩阵的

然后是需要差异比较矩阵的

大家运行一下这些代码就知道，两者结果是一模一样的。

而差异比较矩阵的需要与否，主要看分组矩阵如何制作的！

design=model.matrix(~factor(sCLLex$Disease))

design=model.matrix(~0+factor(sCLLex$Disease))

有本质的区别！！！

前面那种方法已经把需要比较的组做出到了一列，需要比较多次，就有多少列，第一列是截距不需要考虑，第二列开始往后用coef这个参数可以把差异分析结果一个个提取出来。

而后面那种方法，仅仅是分组而已，组之间需要如何比较，需要自己再制作差异比较矩阵，通过makeContrasts函数来控制如何比较！

首先做第一个数据，基因表达矩阵！

自己在NCBI里面可以查到下载地址，然后用R语言读取即可

exprSet=read.table("GSE63067_series_matrix.txt.gz",comment.char = "!",stringsAsFactors=F,header=T)

rownames(exprSet)=exprSet[,1]

exprSet=exprSet[,-1]

然后做好分组矩阵，如下

然后做好，差异比较矩阵，就是说明你想把那些组拿起来做差异分析，如下

最后输出结果：

我进行了6次比较，所以会输出6次比较结果

最后打开差异结果，解读，说明书如下！

忒

在我的github有完整代码