都来aviv Regev自于实验室，一系列文章都利用了单细胞转录组数据分析CNV。

2014年关于GBM的science文章

首先是2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，提到了这个分析点，然后还用了CCLE数据库验证可靠性。

该文章自己的单细胞转录组数据建库选用了 SMART-seq 方法，公布在 GSE57872

• 430(576) single glioblastoma cells isolated from 5 individual tumors
• 102(192) single cells from gliomasphere cells lines

这个单细胞转录组建库方式有点落后了：

SMART-seq protocol was implemented to generate single cell full length transcriptomes (modified from Shalek, et al Nature 2013) and sequenced using 25 bp paired end reads. Single cell cDNA libraries for MGH30 were resequenced using 100 bp paired end reads to allow for isoform and splice junction reconstruction (96 samples, annotated MGH30L).

所以作者过滤的比较严格，可以直接下载其分析好的表达矩阵，也可以下载原始测序数据自己走一波转录组流程。

第一次提出的公式如下：

2016年关于melanoma的science文章

然后是2016年关于melanoma的science文章：PMID: 27124452 也应用了单细胞转录组数据分析CNV，该文章的数据公布在 GSE72056 这次使用的Smart-seq2建库技术，共计 4645 个细胞，仅仅是表达矩阵就由71Mb，但是原始的测试数据在 dbGaP 数据库，需要申请才能下载。

we applied single-cell RNA sequencing (RNA-seq) to 4645 single cells isolated from 19 patients, profiling malignant, immune, stromal, and endothelial cells.

值得注意的是作者还做了bulk的转录组测序，针对6个处理 RAF or RAF+MEK inhibitors 前后供12个数据，公布在 GSE77940

这个时候的计算公式稍微有点变化了，如下：

2016年CELL杂志发表的关于头颈癌

接着是2016年CELL杂志发表的关于头颈癌的文章：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 测序如下；

We profiled transcriptomes of ∼6,000 single cells from 18 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, including five matched pairs of primary tumors and lymph node metastases.

同时也对这些病人测了whole-exome sequencing (WES) and targeted genotyping (SNaPshot) data，但是这些数据公布在 phs001474.v1.p1 ，不是很方便下载。

单细胞转录组建库用的Smart-seq2方法，所有的数据公布在 GSE103322 ， 仅仅是表达矩阵都有近100Mb了。

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz | 86.0 Mb |

下载地址是： (ftp)(http)

用CCLE数据做验证

2014年关于GBM的science文章；PMID: 24925914 ，文章提到：

We downloaded the CCLE gene-centric RMA-normalized Affymetrix data (http://www.broadinstitute.org/ccle/), and centered the expression of each gene across all cell lines at zero.

需要简单注册后才能下载：https://portals.broadinstitute.org/ccle/users/sign_in

理论上要得到下面的图：

](http://www.bio-info-trainee.com/wp-content/uploads/2018/02/highly-correlated-CNV-by-SNP6array-and-RNA-seq.png)

说明使用转录组数据分析到的CNV情况和SNP6.0芯片的结果差异不大。

还有GTEx数据库的验证

To compare these patterns to an external reference of normal cells we downloaded RNA-Seq data from the GTEX portal (http://www.gtexportal.org/; gene read counts file from Jan. 2013), and estimated CNV values as above: we normalized the read counts into log2(TPM+1), averaged all brain samples, restricted the data to the ~6,000 analyzed genes, subtracted for each gene the average normalized expression from the GBM single-cell data (this step is comparable to the centering of the single cell data) and then used a moving average of 100 genes over the genomically-ordered list of genes to define CNV-cont.

总结

上述文章及数据都是有表达矩阵可以下载，所以仅仅是根据这些文章的补充材料公布的公式即可重复整个流程啦。

文章发表于2017年12月，在CELL杂志：Single-Cell Transcriptomic Analysis of Primary and Metastatic Tumor Ecosystems in Head and Neck Cancer 测序如下；

We profiled transcriptomes of ∼6,000 single cells from 18 head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) patients, including five matched pairs of primary tumors and lymph node metastases.

同时也对这些病人测了whole-exome sequencing (WES) and targeted genotyping (SNaPshot) data，但是这些数据公布在 phs001474.v1.p1 ，不是很方便下载。

单细胞转录组建库用的Smart-seq2方法，所有的数据公布在 GSE103322 ， 仅仅是表达矩阵都有近100Mb了。

GSE103322_HNSCC_all_data.txt.gz | 86.0 Mb |

下载地址是： (ftp)(http)

实验验证用的是细胞系 Oral cavity HNSCC cell lines (Cal-27, SCC9, SCC4, SCC25, and JHU-006; all derived from male patients) 做了RNA-seq 数据。

肿瘤内异质性是肿瘤学的主要挑战。在新兴的技术中，scRNA-seq有助于确定与肿瘤生物学，诊断和治疗有关的发育等级，抗药性程序和免疫渗透模式。在这里，研究者应用这种方法来表征原发性HNSCC肿瘤和匹配的LN转移瘤。

名词介绍

• 头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）
• 淋巴结转移（LN）
• 癌症基因组图谱（TCGA）
• 癌相关成纤维细胞（CAF）
• 细胞外基质（ECM）
• 循环肿瘤细胞（CTC）
• 单细胞RNA测序（scRNAseq）
• 肿瘤微环境（TME）
• 全外显子组测序（WES）和靶向基因分型（SNaPshot）
• Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)
• PNI = perineural invasion; LVI = lymphovascular invasion; ECE = extracapsular extension

​

背景介绍

HNSCC 头颈癌是最常见的十大癌症之一，每年有50万患者深受其害，其中，超过80%的患者为口腔鳞状细胞癌(OSCC)。尽管目前有手术、化疗、放疗等治疗手段，但5年存活率仅有50%，仍是存活率最低的癌症之一，且近30年没有改善。所以探寻新的治疗方式抑制OSCC生长和转移尤为重要。

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种与酒精和烟草暴露密切相关的具有异质性的上皮肿瘤，患者往往在晚期出现的淋巴结转移（LN)。

单细胞转录组数据分析CNV跟WES的对比

首先把所有病人的近6000个细胞根据表达模式区分成恶性与否，分成两组进行CNV聚类，可以看到恶性细胞的CNV模式跟从WES数据分析得到的CNV模式比较类似，说明了单细胞转录组数据分析CNV是靠谱的。当然，本身该课题组前面的几篇文章就提到了这个方法以及证实了其可靠性。

病人MEEI5的CNV情况

MEEI5 是一个69岁的女性，对来源于她的所有单细胞的转录组数据分析得到的CNV信息进行聚类可以看到比较清晰的patter，其中恶性与否比较容易区分，而且对于恶性细胞也可以看出原位癌和转移癌的区别。

首先区分肿瘤细胞的恶性与否

用Smart-seq2建库方法得到的单细胞转录组数据经过QC后，留下了来自18名患者的5,902个细胞，首先可以分成2215个恶性细胞和3363个非恶性细胞。

首先，研究者根据跨染色体间隔的平均表达谱推断每个单细胞中的大规模染色体拷贝数变异（CNV）。这些推断的CNVs与WES一致，通过推断的CNVs将恶性细胞从正常核型的非恶性细胞中分离出来。

其次，研究者通过其上皮来源鉴别恶性细胞，其不同于TME中的基质和免疫细胞。研究者发现在具有上皮标志物表达的细胞和具有异常核型的细胞之间具有显著的一致性。

最后，研究者通过它们的全局表达模式将细胞划分到初始类。基于CNV和上皮标志物分析，绝大多数细胞均被分到具有一致恶性或非恶性分类类中去。

非恶性细胞的聚类没有个体差异

如果只对已经被区分出来的三千多个非恶性肿瘤细胞进行聚类，采取SC3算法，效果如下图，虽然有14个类别，但是根据已知标记基因的表达，可以注释为B细胞，巨噬细胞，树突状细胞，肥大细胞，内皮细胞，成纤维细胞和肌细胞这八个值得探究的类别。

值得注意的是，每个类含有来自不同患者的细胞，表明TME(这三千多个非恶性细胞就是肿瘤微环境)中的细胞类型和表达状态在HNSCC肿瘤中基本一致，并且没有患者特异性亚群或批处理效应，尽管它们的比例是不同的。

而且由于研究者的数据集中T细胞和成纤维细胞，即数量相对较多，研究者通过更精确的聚类发现了T细胞和成纤维细胞的多样性。如下：

单独查看成纤维细胞CAF

rv1,500成纤维细胞分成两个大类，一个小类别。

• 第一个类表达肌成纤维细胞的经典标记，包括α平滑肌肌动蛋白（ACTA2）和肌球蛋白轻链蛋白（MYLK，MYL9）。肌成纤维细胞是TME的成熟组分，并与伤口愈合和挛缩有关。
• 第二个类表达与癌相关成纤维细胞（CAF）相关的受体，配体和细胞外基质（ECM）基因，包括成纤维细胞活化蛋白（FAP），podoplanin（PDPN）和结缔组织生长因子（CTGF）。
• 第三个类基本不包括肌成纤维细胞和CAF的标记物，并可能代表处于静止状态的成纤维细胞。

其中还可以把CAFs（第二个类）分为具有立即早期应答基因（例如JUN，FOS），间充质标志物（例如VIM，THY1），配体和受体（例如FGF7）差异表达的两种类型（CAF1和CAF2），TGFBR2 / 3）和ECM蛋白质（例如MMP11，CAV1）。这种瘤内CAF异质性与TMF中涉及复杂结构和旁分泌相互作用的观点一致。

单独查看T细胞

主要T细胞类（rv1000个T细胞）可以分为四个亚群，研究者注释为

• 调节性T细胞（Treg）
• 常规CD4 + T辅助细胞（CD4 + Tconv）
• 两种细胞毒性CD8 + T细胞群（CD8 + T和CD8 + Texhausted）

细胞毒素亚型在共抑制性受体（例如PD1，CTLA4）和与T细胞功能障碍和衰竭相关的其他基因的表达方面不同，并由此定义HNSCC中推定的T细胞耗竭程序。耗竭CD8 + T细胞的部分在研究者的队列患者中显著变化。这些T细胞表达状态可以为理解和预测检查点免疫疗法的反应提供帮助。

恶性细胞聚类完全取决于患者个体

与非恶性细胞相比，2215恶性细胞根据其起源的肿瘤聚类。超过2000个基因优先在个体肿瘤中表达。

差异表达的基因在肿瘤之间不同的CNV内富集。

最后，其他差异表达的基因与应激（例如JUNB，FOSL1）或免疫激活（例如IDO1，STAT1，TNF）有关，可能对不同的TME有反应。因此，肿瘤间恶性细胞表达异质性反映了研究者队列中肿瘤之间遗传学，亚型和TME的差异。

恶性细胞的基因特征

这里重点分析那些含有恶性细胞转录组最多数量的10对肿瘤样本。比如下面的病人MEEI25，一个76岁的女性：

研究者使用非负矩阵分解来揭示在恶性细胞亚群中得到优先共同表达的一系列基因。例如，对于MEEI25恶性细胞，研究者定义了6个不同的基因特征。对10个肿瘤样本中的每一个都应用该方法，共定义了60个基因特征。

接下来，研究者使用层次聚类来将这些60个特征提取成元特征，这些元特征反映了在多个肿瘤内变化的常见表达程序。来自不同肿瘤的特征之间的高一致性表明它们反映了肿瘤内表达异质性的共同模式。

LN转移与原发性肿瘤比较

研究者将LN转移与原发性肿瘤（只有5个病人是取了配对样本）进行了比较。尽管WES和推测的CNV显示了原发性和匹配的LN样本之间的存在一些基因组差异，但是可能是由于所研究的个体数量较少，他们没有鉴别出任何一致的区别。

LN中恶性细胞的表达谱也与相应的原发肿瘤大致匹配。在每个配对样本中，都有较少的差异表达基因是显著差异的，但是它们在整个群体（cohort）中不一致。

研究者还观察到淋巴结和原发性肿瘤间质和免疫细胞的特征和表现的总体一致性，虽然有一些重要的区别！

EMT的部分状态或p-EMT

EMT程序被广泛认为是耐药，侵袭和转移的潜在驱动因素，是一个连续和变化的过程。因此，研究者仔细检查了ECM计划中EMT的特征。除ECM基因如基质金属蛋白酶，层粘连蛋白和整联蛋白外，该程序还包括EMT标志物波形蛋白（VIM）和整联蛋白α-5（ITGA5）。此外，该方案中得分最高的基因之一是转化生长因子（TGF）-b诱导（TGFBI），暗示经典的EMT调节剂TGF-b。

虽然该程序具有经典EMT的关键特征，但缺乏其他标志。

首先，虽然特征伴随着某些上皮基因的表达降低，但是上皮标记物的总体表达还是明显地保持下来。

其次，研究者没有检测到经典EMT TF，ZEB1 / 2，TWIST1 / 2和SNAIL1的表达。只有SNAIL2被检测到（在70％的HNSCC细胞中），尽管其表达与肿瘤的程序相关，但与肿瘤内个体细胞的程序并不相关。最近的研究表明SNAIL2比其他EMT TFs早。 SNAIL2也涉及伤口愈合中的p-EMT应答。

因此，研究者建议这里确定的体内程序反映了一个EMT的部分状态或p-EMT。

上图的分析结果表明，这个p-EMT程序不同于源自细胞系和肿瘤模型的完整EMT程序，以及源自肿瘤的肿瘤谱间充质特征。

把TCGA的分类应用于scRNA-seq数据

TCGA研究分析了数百个HNSCC肿瘤的表达谱，并将它们分为四个亚型：基础型，间充质型，经典型和非典型型。在TCGA的cohort里面各个类别的样本比例是：atypical(24％),mesenchymal(27％),basal(31％)和classical(18％)。尽管TCGA分型是从大量肿瘤细胞中获取的，但研究者推断单个细胞组分的表达程序可能使研究者能够提取更多的了解。具体而言，研究者从这些批量数据中定义的分子亚型判断是否能够反映恶性程序，恶性细胞组成和/或TME组成的差异。

研究者首先确定了自己研究计划的十个HNSCC肿瘤病人的TCGA表达亚型。

研究者评估了每个肿瘤的恶性细胞与其亚型表达特征的对应关系。引人注目的是，每个肿瘤清楚地映射到三个亚型之一：基本型（n = 7），经典型（n = 2），或非典型（n = 1）。没有一个恶性细胞映射到间充质亚型，即使它是口腔肿瘤中第二常见的亚型。然而，当研究者增大分析样本数目，当样本中包括基质和免疫细胞时，发现数百CAFs、肌成纤维细胞和肌细胞映射到间充质亚型。

这一发现提出了一种可能性，即TCGA间充质亚型反映大批量样品中的高基质表现而不是独特的恶性细胞程序。实际上，TCGA样品的分析鉴定到间充质亚型肿瘤高度表达对CAF和肌细胞特异性的基因。此外，当研究者检查TCGA的HNSCC肿瘤的组织学切片时，鉴定到间充质肿瘤的成纤维细胞比基础型肿瘤多大约2.7倍（t检验，p <0.0001）。

外显子数据分析somatic突变

因为外显子测序数据是无法下载的，这里就不过多介绍了。

时间序列单细胞转录组数据分析

文章是: Reconstruction of developmental landscapes by optimal-transport analysis of single-cell gene expression sheds light on cellular reprogramming. 虽然于2017年9月公布在了bioRxiv上面，但是至今仍然没正式发表，包含了六万多个单细胞转录组数据，持续追踪了MEF细胞系诱导为IPSC细胞的动态变化过程，并且从发育的角度分析了这些数据

We demonstrate the power of WADDINGTON-OT by applying the approach to study 65,781 scRNA-seq profiles collected at 10 time points over 16 days during reprogramming of fibroblasts to iPSCs.

背景介绍

Waddington提出的发育景观

上世纪50年代，胚胎发育生物学家Conrad Hal Waddington提出的发育景观假说认为，分化成熟的细胞变回多能干细胞是个不可能发生的事件。但是日本京都大学教授山中伸弥于2006年却发现并验证，这种细胞可以发育成为身体各种组织细胞。iPS细胞的发现成就了目前轰轰烈烈的干细胞研究领域，山中伸弥教授也因此获得2012年诺贝尔生理或医学奖。
iPS (诱导多潜能干细胞)重编程实验的涌现使人们重新重视了上个世纪50年代胚胎发育生物学家Waddington提出的发育景观。虽然它只是一个隐喻,但其形象地描述了细胞的自发的层次分叉过程并隐含了细胞类型之间转换的可能性,从而作为一个整体框架最近被广泛应用来解释细胞发育和重编程。
详见：https://zhuanlan.zhihu.com/p/25333058
Waddington 在两个时期提出的假说：

• initially (1936) illustrated by railroad cars on switching tracks (A)
• later (1957) by marbles rolling in a landscape (B), with trajectories shaped by hills and valleys.
  如图：
  

  最优传输理论

  最优传输理论(Optimal Transport)，也叫Monge-Kantorovich Problem。最早由法国数学家Monge提出，二战期间由俄国数学家Kantorovich推广后开始迅速发展，Kantorovich也因他在这个领域做出的贡献得了1975年的经济学诺贝尔奖。
  Monge最早提出的问题可以理解为，有一堆土在地点A，现在我们要将这堆土转移到地点B，但是我们运土是要费体力的，怎么搬这些土可以让我们的体力消耗降到最小。现在我们量化这个问题，将土在地点A的分布称之为”Initial Distribution”，在地点B的分布称为”Final Distribution”，我们称消费的体力为Cost，通过一个”Cost Function”计算得出，每种搬运方案为一个”Mapping”。我们现在要在所有Mapping中寻找Cost最低的那一个，这就是最优传输理论要解决的问题。
  可能看完这些，有的小伙伴还是不太懂搬运方案和Mapping是怎样一回事。这里解释一下，比如在地点A和地点B的时候，土堆的形状都要形成一个标准正态分布 N(0, 1)，我们”将A土堆中间的土先搬过去形成B土堆的尾巴”和”将A土堆的土直接放到B土堆对应位置”所消耗的体力大部分情况下是不一样的，这就是两种不同的方案对应着不同的Cost。
  这几年，由最优传输理论衍生出来的”Martingale Optimal Transport”在金融数学有不少应用，有不少人在研究。简单的说就是给这些”Mapping”加了个限制，要求他们必须是”Martingale”。
  如图:
  

  发育生物学家感兴趣的基本问题

  如下：

• What classes of cells are present at each stage?
• For the cells in each class, what was their origin at earlier stages, what are their potential fates at later stages, and what is the actual outcome of a given cell?
• To what extent are events along a path synchronous or asynchronous?
• What are the genetic regulatory programs that control each path?
• What are the intercellular interactions between classes of cells?
• How deterministic or stochastic is the process—that is: if, and how early, does it become determined that a particular cell or an entire cell class is destined to a specific fate?
• For a given origin and target fate, is there only a single path to the target, or are there multiple developmental paths?
• To what extent is the process cell-intrinsic, driven by intracellular mechanisms that do not require ongoing external inputs, or externally regulated, being affected by other contemporaneous cells?
• For artificial processes such as induced reprogramming, there are additional questions: What off-target cell classes arise?
• To what extent do cells activate normal developmental programs vs. unnatural hybrid programs?
• How can the efficiency of reprogramming be improved?
  示意图如下；
  
  然后列举一些前人在探索这些问题方面的研究成果，指出他们做的还不够。而单细胞转录组测序技术非常强大，适合解决这个问题。
  单细胞转录组在探索发育轨迹这方面也有过一些应用了，主要的算法集中于3个：
• k-nearest neighbor graphs
• binary trees
• diffusion maps
  他们的缺陷很明显，有3个：
• 首先为那些稳定的生物学过程设计的，比如cell cycle or adult stem cell differentiation
• 其次，单细胞本身也是多种生物学状态的叠加，比如cell proliferation and death就会影响那些算法的表现。
• 最后，大部分模型的假设限制很大，比如one-dimensional trajectories and zero-dimensional branch points
  所以作者把Optimal Transport (OT)的算法，应用到了时间序列的单细胞转录组数据来探索发育的过程。当然，表现很好的啦，揭示了重编程的分子机理。
  几大发现如下：
• (1) identifying alternative cell fates, including senescence, apoptosis, neural identity, and placental identity;
• (2) quantifying the portion of cells in each state at each time point;
• (3) inferring the probable origin(s) and fate(s) of each cell and cell class at each time point;
• (4) identifying early molecular markers associated with eventual fates;
• (5) using trajectory information to identify transcription factors (TFs) associated with the activation of different expression programs.
  

  单细胞转录组数据处理

  首先得到表达矩阵

  因为是 10X Genomics数据，所以直接用官方工具CELLRANGER 即可，过滤后得到
  65,781 cells and G = 16, 339 genes 的表达矩阵

  然后降维

  先过滤掉那些在所有细胞表达没什么变化的基因，这一步利用的是R包SEURAT的MeanVarPlot函数，剩下2076个基因。
  然后使用 diffusion component embedding进行降维处理，，这一步利用的是R包 DESTINY。
  分析了top100 diffusion components的，发现只有top20是显著的富集到 developmental processes ，所以作者只选取了top 20 diffusion components

  可视化

  现在剩下了20*65781的矩阵，首先使用R语言的FNN包里面的 fast k-NN algorithm ，然后利用ForceAtlas2算法计算 force-directed layout on the k-NN graph

  单细胞聚类

  同样的剩下了20*65781的矩阵，使用了 Louvain-Jaccard community detection 算法，默认参数分成33类
  

  最优传输算法

  主要就是考量 proliferation score和growth rate，

  基因调控网络

  自己写Python脚本做的分析，公式有点多而且有点复杂，但是里面提到了Shannon diversity of the transport maps
  

  基因表达模块

  使用了Graphical Lasso算法，来自于R包glasso，还用了R包IGRAPH的Infomap community detection 算法看基因模块的网络结构。
  使用HOMER软件的findGO.pl测序对基因模块注释到biological signatures
  每个基因集合的特征分数算法就是它里面的所有基因的z-score的平均值。

  与3个已有算法比较

  见文末

  实验环节：iPSC

  We obtained mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from a single female embryo homozygous for ROSA26-M2rtTA, which constitutively expresses a reverse transactivator controlled by doxycycline (Dox)
  多西环素(Doxycycline)，具有抗炎作用,也称作是强力毒素(doxycycline)，a Dox-inducible polycistronic cassette carrying Pou5f1 (Oct4), Klf4, Sox2, and Myc (OKSM), and an EGFP reporter incorporated into the endogenous Oct4 locus (Oct4-IRES-EGFP).
  We plated MEFs in serum-containing induction medium, with Dox added on day 0 to induce the OKSM cassette (Phase-1(Dox)).
  第八天之后把添加的dox取出来，然后把细胞转移到serum-free N2B27 2i medium (Phase-2(2i)) 和serum (Phase-2(serum)).这两种培养条件下，直到细胞系表达出内源性的Oct4，认为是重编程成功。
  如图：
  
  在各个时间段均测量了好几千个细胞的表达谱，总共65781个细胞。

  发育景观

  作者花了5大段在描述下面的图：
  
  可以看到细胞发育始于第0天，很容易理解，而且绝大部分的0天细胞都能被聚成一个类，表现为强烈MEF identity的signature信号。但是第二天的Dox处理后，细胞被诱导高表达OKSM cassette，而且开始转变为3个不同的clusters，但总体来说这3类都表现很强的增殖信号。
  第4天后细胞很明显朝着两个不同的方向变化，这里定义为：Valley of Stress and the Horn of Transformation。
  Following Dox withdrawal and media replacement on day 8, the cells in the Horn adopt one of four alternative outcomes by day 12 (senescence, neuronal program, placental program, and pre-iPSCs).

  cluster之间的转移

  作者提到了we partitioned the 16,339 detected genes into 44 gene modules and the 65,781 cells into 33 cell clusters，那这33个cluster分属于不同的发育时间，它们之间的发育转移关系如下图：
  
  尽管属于同一个发育时间节点，但是仍然是有发育快慢等多样性，同一发育时间点的不同特性的cluster细胞接下来的命运也差异很大：
  By day 4, cells display a bimodal distribution of properties that is strongly correlated with their eventual descendants:

• cells in cluster 8 (low proliferation, high MEF identity) have 95% of their descendants in the Valley,
• while cells in cluster 18 (high proliferation, low MEF identity) have 94% of their descendants in the Horn
• Cells in cluster 7 show intermediate properties and have roughly equal probabilities of each fate
  同时挑选了一系列已有的signature来检查它们在发育景观的表现：
  
  当然，也检查了一下marker基因的表达变化情况，就不截图了。

  重点关注5类细胞

  不同发育时期的细胞可以分成33类，写起了太麻烦，作者挑选了值得讲故事的5类细胞：

• placental-like cells (clusters 24 and 25) at day 12
• neural-like cells (clusters 26 and 27) at day 16.
  还有iPSCs,Senescent cells, Apoptotic cells.
  
  主要也就是提一下他们的特征，高表达哪些基因，它们的来源和去向问题。

  3个其它软件的效果

  
  
  
  这些软件之所以不适用于作者的这个实验设计出来的数据，因为没有考虑到发育时期这个已知的变量。
  虽然在作者写作的时候也已经出来了一款新的软件，但测试了，效果也不如作者自己开发的算法。

  后记

  这篇文章做的数据实在是太大，而且分析要点太多，涉及到的算法也非常多，实在是没办法一一解读，估计得开一个讨论班，五六个人一起解读。
  比如下面这个课题组就讨论过；
  

文章：A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer , 因为bulk测序无法解决问题，所以作者选择了单细胞转录组测序策略：

To understand functional properties associated with heterogeneous EGFR expression in an unbiased manner, single cell RNA-seq was performed on freshly dissociated cells from the PDX (3,483 cells, with an average of 40,564 unique molecular identifiers (UMIs) and 5,146 genes detected per cell)

数据都在SRA数据库里面，如下：https://trace.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP110989

但是作者并没有给表达矩阵，所以只能自行下载原始数据进行单细胞转录组全流程处理。

mkdir -p ~/data/public/TNBC/
cd ~/data/public/TNBC/
nohup wget -c ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR579/SRR5799774/SRR5799774.sra & 
nohup wget -c ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR579/SRR5799776/SRR5799776.sra & 
nohup wget -c ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR579/SRR5799775/SRR5799775.sra &

nohup ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 SRR5799774.sra &
nohup ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 SRR5799775.sra &
nohup ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump --gzip --split-3 SRR5799776.sra &

下载并且解压后是：

1.7G Jan 22 23:34 SRR5799774_1.fastq.gz
 13G Jan 22 23:34 SRR5799774_2.fastq.gz
9.4G Jan 22 17:40 SRR5799774.sra
1.7G Jan 22 23:33 SRR5799775_1.fastq.gz
 13G Jan 22 23:33 SRR5799775_2.fastq.gz
9.4G Jan 22 17:31 SRR5799775.sra
2.9G Jan 23 00:55 SRR5799776_1.fastq.gz
 24G Jan 23 00:55 SRR5799776_2.fastq.gz
 18G Jan 22 18:25 SRR5799776.sra

可以看到左右端数据文件大小差别很大，因为这个不是普通的双端测序。

需要在作者的文章里面找到测序的描述，这篇文章的补充材料有介绍：

26 bp Read1, 8 bp I7 Index, 0 bp I5 Index and 98 bp Read2.

测序数据量是：a total of 717,982,475 reads, and 179,137 reads per single-cell

因为是 10x Genomics方法做的单细胞转录组数据，所以需要使用他们发表的工具来处理：Cell Ranger ，需要简单注册才能下载安装，我下载了一个测试数据，发现：

├── [237M] neurons_900_S1_L001_I1_001.fastq.gz
├── [642M] neurons_900_S1_L001_R1_001.fastq.gz
├── [1.8G] neurons_900_S1_L001_R2_001.fastq.gz
├── [238M] neurons_900_S1_L002_I1_001.fastq.gz
├── [646M] neurons_900_S1_L002_R1_001.fastq.gz
└── [1.8G] neurons_900_S1_L002_R2_001.fastq.gz

可以看到左右端测序数据大小不一致，而且每次测序是有3个数据，因为26bp read1 (16bp Chromium barcode and 10bp UMI), 98bp read2 (transcript), and 8bp I7 sample barcode ，只有reads2的fastq里面是真正的转录本序列，另外的两个文件都是barcode！可以直接用 Cell Ranger 来做分析，代码如下：

/home/jianmingzeng/biosoft/10xgenomic/cellranger-2.1.0/cellranger count --id=neurons \
--localcores 5 \
--transcriptome=/home/jianmingzeng/biosoft/10xgenomic/db/refdata-cellranger-mm10-1.2.0 \
--fastqs=/home/jianmingzeng/data/public/10x/neurons_900_fastqs \
--sample=neurons \
--expect-cells=900

但是作者上传的数据缺失了关键信息，我写信给10x genomics公司的人咨询了这件事

I just read a paper: A Targetable EGFR-Dependent Tumor-Initiating Program in Breast Cancer
and they choose 10x genomics for scRNA-seq, and upload the raw data into SRA database.

While I’ve download them, there should be 26 bp Read1, 8 bp I7 Index, 0 bp I5 Index and 98 bp Read2.

But I just found the 8 bp in fq1, and 98bp in fq2, the key information just lost , which means I can’t use the Cell Ranger to process them.

Any help ?

公司回复我说，如果缺失barcode信息，这个数据是没办法处理的。

Michael Campbell (10x Genomics)Jan 26, 07:03 PST Hi Jianming,

That’s right if you don’t have the 26bp read with the 10x barcode and UMI in it you can’t use Cell Ranger, or any other tool for that matter because there is no way to related the second read to the cell it came from. I would contact the corresponding author to see what happened to the R1 read. If you want, you can send me the SRR number and I can have a look to see if the R1 read is buried somewhere.

Best,
Mike

然后我给出了文章以及SRA号，公司的任又检查了一遍，的确是作者的失误。

Hi Jainming,

It looks like they uploaded the index read as read 1 instead of the read with the barcode. It’s not analyzable in this format.

Best,
Mike