首先要下载并且得到人类基因组的外显子坐标记录文件

这里我用的参考基因组版本仍然是hg19，所以去CCDS数据库里面下载对应版本，并且格式化成BED文件。

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/CCDS/archive/Hs37.3/CCDS.20110907.txt
cat CCDS.20110907.txt |perl -alne '{/[(.*?)]/;next unless $1;$exons=$1;$exons=~s/\s//g;$exons=~s/-/\t/g;print "$F[0]\t$" foreach split/,/,$exons;}' >hg19exon.bed

​

制作好的bed格式的人类全部的exon区域坐标文件如下：

1 801942 802433
1 861321 861392
1 865534 865715
1 866418 866468
1 871151 871275
1 874419 874508
1 874654 874839å
1 876523 876685
1 877515 877630
1 877789 877867

从VCF文件里面根据BED文件进行抽提

这里就不自己造轮子了，用现成的工具，而且是我们用过很多次的SnpEff套件，代码如下

cat snp.vcf | java -jar ~/biosoft/SnpEff/snpEff/SnpSift.jar intervals hg19exon.bed >hg19exon.snp.vcf
cat indel.vcf | java -jar ~/biosoft/SnpEff/snpEff/SnpSift.jar intervals hg19exon.bed >hg19exon.indel.vcf

可以把我经由GATK best practice流程得到的SNP/INDEL记录的VCF文件都进行提取，用代码 wc -l *vcf简单统计一下提取的效果，如下：

 1042 hg19_exon.indel.vcf
 25067 hg19_exon.snp.vcf
 754755 indel.vcf
 3784343 snp.vcf

很明显可以看到，位于外显子区域的mutation毕竟是少数，这时候还可以继续看看那些在外显子上面却没有被dbSNP数据库记录的mutation还有多少:
cat hg19_exon.snp.vcf |grep -v "^#" |cut -f 3 |grep '\.' |wc
仍然有2315个SNV在外显子区域，却没有被dbSNP数据库记录，可能是我的家族特异性的位点，属于正常的基因型多样性，也有极小的可能性这些位点是后发突变，也就是通常癌症研究领域的somatic mutation 。
用下面的代码可以简单浏览一下这些在外显子上面的未知突变的情况。

cat hg19_exon.snp.vcf |perl -alne '{print if $F[2] eq "."}' |less -S
cat hg19_exon.indel.vcf |perl -alne '{print if $F[2] eq "."}' |less -S

下一讲我们再进一步注释。

在前面我们提到了用ChIP-seq的分析方法可视化了一下我的WGS数据，结果我们的测序深度分布居然是跟基因组的genomic feature相关的~~~
比如在TSS附近，就很明显看到了一个测序深度峰值，那么前面我们并没有给出直接的解答，而且简单的提了一下这是二代测序的特点，GC含量片段偏好性！
作为一个合格的生物信息学工程师，我当然要把这个理论用自己的代码和数据来亲身实践一遍~
我首先把全基因组的bam文件用mpileup模式输出，根据1000bp的窗口滑动来统计每个窗口的测到的碱基数，GC碱基数，测序总深度！
代码比较复杂，一般人可能理解不来的！

samtools mpileup -f ~/reference/genome/human_g1k_v37/human_g1k_v37.fasta ../P_jmzeng.final.bam|head -1000000 |perl -alne '{$pos=int($F[1]/1000); $key="$F[0]\t$pos";$GC{$key}++ if $F[2]=~/[GC]/;$counts_sum{$key}+=$F[3];$number{$key}++;}END{print "$_\t$number{$_}\t$GC{$_}\t$counts_sum{$_}" foreach sort{$a<=>$b} keys %number}'

而且我代码写的不好，跑10万行需要 4s，跑一百万行需要36s，我估计把这8.9亿行的bam运行完，怎么着也得15个小时。不过不要紧，我们就拿前面的百万行数据做一个测试就好了。
结果如下：

前面两行是窗口的坐标，第几号染色体的第几个窗口，后面3行是数据，分别是每个窗口的测到的碱基数，GC碱基数，测序总深度！
上面的文件就可以导入到R里面进行可视化啦！

PS:这个线性回归图不会看到，自己去搜索哈！(或者去我们生信技能树论坛：http://www.biotrainee.com/thread-695-1-1.html 复制链接到浏览器打开，或者点击阅读原文咯！)
我觉得我这次画的图还不错，很明显能看到这个趋势，GC含量比较高的窗口，有着相应比较高的测序深度！

完美的证明成功啦~
给自己一百个赞，虽然我没有对全基因组数据做验证，但是基因组差异没那么大，我也随机抽样了几次，发现都有这个趋势。

我的R代码如下：

a=read.table('../tmp.txt')
a$GC = a[,4]/a[,3]
a$depth = a[,5]/a[,3]
a = a[a$depth<100,]
plot(a$GC,a$depth)
library(ggplot2)
# GET EQUATION AND R-SQUARED AS STRING
# SOURCE: http://goo.gl/K4yh
lm_eqn <- function(x,y){
m <- lm(y ~ x);
eq <- substitute(italic(y) == a + b %.% italic(x)*","~~italic(r)^2~"="~r2,
list(a = format(coef(m)[1], digits = 2),
b = format(coef(m)[2], digits = 2),
r2 = format(summary(m)$r.squared, digits = 3)))
as.character(as.expression(eq));
}
p=ggplot(a,aes(GC,depth)) + geom_point() +
geom_smooth(method='lm',formula=y~x)+
geom_text(x = 0.5, y = 100, label = lm_eqn(a$GC , a$depth), parse = TRUE)
p=p+theme_set(theme_set(theme_bw(base_size=20)))
p=p+theme(text=element_text(face='bold'),
axis.text.x=element_text(angle=30,hjust=1,size =15),
plot.title = element_text(hjust = 0.5) ,
panel.grid = element_blank(),
#panel.border = element_blank()
)
print(p)

画图参考：http://stackoverflow.com/questions/7549694/ggplot2-adding-regression-line-equation-and-r2-on-graph

著名芬兰运动员Eero Mäntyranta，他拿过七枚奥运奖牌。他的血红细胞远超正常人水平，甚至一度被奥组委误以为服用了禁药。后来经过研究发现，他的EPOR基因上的一个位点rs121918116，发生了一个G>A的变异，使得他的血氧含量达到了普通人的150%，所以他耐力惊人。

在snpPedia里面可以查看这个位点的信息：http://snpedia.com/index.php/Rs121918116

rs121918116, also known as c.1317G>A, p.Trp439Ter or W439X,is a rare mutation in the EPOR erythropoietin receptor gene on chromosome 19.

看得出来这个变异造成了EPOR基因翻译的蛋白的氨基酸的改变，对EPOR基因的功能是有影响的

在dbSNP里面可以查看它在人的hg19坐标系的定位是chr19:11488870

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp_ref.cgi?rs=121918116)

前面我们已经把55G的bam文件按照染色体拆分了，那么我们就在IGB里面直接打开我们的19号染色体的bam文件来查看这个位点吧！

首先在坐标输入框里面输入EPOR基因，可以定位到整个基因，看看基因的全景。

然后输入具体的坐标：

可以看到，我的这个位点，跟参考基因组这个位点的碱基是一模一样的，唉，看来我是没有传说中的运动天赋了。可是我觉得我跳远跳高都还不错呀。(大学记录，立定跳远是2.6米)

(当然，没有这个变异位点其实也是好事，所谓的运动天赋其实是一种病——家族性良性红细胞增多症，这种病会导致人脸红（可能关羽也有这种病，千里走单骑，耐力超好）、嗜睡、容易头痛。)

理论上这种方法可以把我的全基因组数据全部check一遍，这样就知道每个位点是否跟参考基因组不一致了，但是这个工作量太大了，我们作为数据分析人员不会选择这种方式，而是用已经被公认的软件来批量处理。后面我们会讲到，但是软件得到的变异情况，如果某个位点非常重要，推荐用IGV加载bam文件，然后定位到具体的坐标来仔细检查。

比如下面，可以大体上看到RGL3这个基因跟hg19参考基因组不同的地方还真不少，但是呢，这些variation真的影响健康吗？意义大吗？这就需要后面来具体探讨了。

也可以顺便看看第12讲提到的两个rs位点：

6 32666295 :Rs9275319--HLA-DQ

2 191964633 :Rs7574865--STAT4

但是需要载入不同的bam文件，分别是6号染色体和2号染色体，这样可以验证一下是不是我们的bcftools整个软件没有call到变异，是否是假阴性。

参考：

http://wap.sciencenet.cn/blogview.aspx?id=37068

好了 这一集就讲到这里，下面我们会详细讲解用软件CALL SNP 的细节

敬请期待！

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本来应该只需要给我6亿条reads的（PE150测序，人30X），但是足足给了我8.9亿条！（但事实上很多paper发表的基因组高于60X的也不少）

表格里面提到了好几个概念，比如duplicate的reads，一般说的PCR造成的duplicate，在找变异的时候需要去除掉。然后是那些比对到了不同染色体的reads pair，虽然只有2.29% ，也是需要重点分析的。（前面我也讲了如何提取以及分别分析它们！）

如果只是想重新前面的这些统计指标，非常很简单，就是samtools工具提供了一个flagstat功能，用法及结果如下：

samtools flagstat P_jmzeng.final.bam

899361748 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)

8597742 + 0 secondary

0 + 0 supplementary

132556557 + 0 duplicates

890858540 + 0 mapped (99.05% : N/A)

890764006 + 0 paired in sequencing

445382003 + 0 read1

445382003 + 0 read2

853255862 + 0 properly paired (95.79% : N/A)

881249604 + 0 with itself and mate mapped

1011194 + 0 singletons (0.11% : N/A)

20382234 + 0 with mate mapped to a different chr

12511988 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)

从结果很明显可以看到，公司的确给了我8.9亿的reads，这个没错，duplicate的情况也的确是132556557/899361748 = 14.73%，而mapping的情况和proper mapping的情况也都显示好了，可以看到公司用的是同样的命令和方法！没有什么神秘的，我们生信工程师，做得就是这个，而且可以做得更好。

后面的探索全基因组区域中碱基覆盖深度不低于多少X的比例，是需要画一个图，有非常多的现成的工具可以使用，包括 BedTools' genomeCov 、 GATK's DepthOfCoverage，还有Picard suite的几个命令。

其实本身原理很简单，就是把全基因组的每个坐标的depth都得到，然后得到depth的频数，然后画图。

我们可以对每条染色体单独来绘图，也可以针对全基因组来绘图，当然，公司给我们的数据是针对全基因组的。 脚本很简单：

samtools mpileup P_jmzeng.final.bam |perl -alne '{if($F[3]>100){$depth{"over100"}++}else{$depth{$F[3]}++}}END{print "$_\t$depth{$_}" foreach sort{$a <=> $b}keys %depth}' 当是需要运行很久，毕竟全基因组的bam文件太大了。

如果分开运行，可以对下面的各条染色体bam文件批量跑一个脚本

脚本如下：

ls P_jmzeng.final.REF*.bam |while read id

do

echo $id

samtools mpileup $id |perl -alne '{if($F[3]>100){$depth{"over100"}++}else{$depth{$F[3]}++}}END{print "$_\t$depth{$_}" foreach sort{$a <=> $b}keys %depth}' >$id.depth.txt

done

跑完之后，对每条染色体都会输出如下文件：

over100 110789

0 27065

1 1730286

2 2219409

3 2728526

4 3251046

5 3774335

6 4303971

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

后面省略94行，每一行都是两列，第一列是测序深度，第二列是有着该测序深度的位点是多少个！所以行的第二列加起来，就是染色体的长度！！！面这个例子是X染色体的，绘图如下，可以看到X染色体的测序深度其实并不怎么好，全基因组测序深度平均高达44X，可是这个X染色体超过44X的只占极少的比例。

我用excel表格简单画个图如下：（当然，作为一个高级生物信息学工程师，用excel表格是有点low，但是这里只是为了说明一个问题，我们后面还是写程序的，用R语言）

比如我们再看看10号染色体，我随意在R里面画了个图：

a=read.table('P_jmzeng.final.REF_10.bam.depth.txt',stringsAsFactors = F)

plot(a[,2],type = 'l',xaxt="n",lwd=3)

axis(1, at = 1:nrow(a),labels =a[,1] , las=1)

abline(v=44)

可以看到10号染色体的测序深度要显著好于X染色体，大部分的测序深度都超过了30X！！（不过，这里虽然用来R，但是出图很丑，虽然不是专业做可视化的，但是想调整美观一点问题也不大，就是好耗费时间。）

做出depth的累积曲线图了，也是很简单的！

a=read.table('P_jmzeng.final.REF_10.bam.depth.txt',stringsAsFactors = F)

over100=a[1,]

a=a[-1,]

a=rbind(a,over100)

a[,3]= cumsum(a[,2])

a[,4]= 1-a[,3]/sum(a[,2])

plot(a[,4],type = 'l',xaxt="n",lwd=3)

axis(1, at = 1:nrow(a),labels =a[,1] , las=1)

abline(v=10);abline(v=20);abline(v=30)

最后得到的数据如下：第4列，就是不低于多少X的比例

可以看到大于10X测序深度的比例仍然高达92.88%，效果杠杠的！！

这个测序深度累积分布图，就是很多人的重点！！！！（请大家仔细学习我上面的统计脚本和画图方法）

加油吧，骚年！！！！

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参考：

https://www.biostars.org/p/104063/

http://www.gettinggeneticsdone.com/2014/03/visualize-coverage-exome-targeted-ngs-bedtools.html

我在第 8讲中写道，每条染色体的覆盖度都接近于100%，而且测序深度大多在40X以上，不少读者表示看晕了，明明这个条形图显示覆盖度不到60%呀！其实是公司的这个图没有做好，它里面的覆盖度用的是最上面的曲线显示的，条形图是测序深度！！！

测序深度和覆盖度的示意图如下：

那么我们就来自己动手统计一下比对好的sam/bam文件的测序深度和覆盖度吧！

这个统计主要依赖于samtools的depth功能，或者说mpileup功能，输入文件都是sort好bam格式的比对文件。事实上，你如果读samtools的源代码就会发现，其实depth功能调用的就是mpileup的函数。但是mpileup可以设置一系列的过滤参数。而depth命令是纯天然的，所以mpileup的结果一定会小于depth的测序深度。对mpileup，可以不选择-u -f 参数指定参考基因组，因为我们只需要测序深度情况，还有，可以指定-q 1 来过滤掉多比对情况。还可以用-Q来过滤低质量的碱基(base pair),用-A来过滤无法定位的reads，结果如下：

针对这个全基因组位点的统计结果，我们很容易写脚本来计算每条平均的测序深度和各个染色体的覆盖度。

nohup time samtools mpileup P_jmzeng.final.bam |perl -alne '{$pos{$F[0]}++;$depth{$F[0]}+=$F[3]} END{print "$_\t$pos{$_}\t$depth{$_}" foreach sort keys %pos}' 1>coverage_depth.txt 2>coverage_depth.log &

nohup ... & ...为命令 表明命令后台执行  也可以

nohup ... & > *.log 将运行结果 写入到一个log文件里面

time 命令 可以统计 命令 运行的时间

这个脚本运行会比较慢，因为是针对整个55G的bam文件。耗时如下：

real 130m34.855s

user 237m14.308s

sys 1m45.692s

结果如下：

其中chromosome的长度在bam文件里面可以看到，用samtools view -H P_jmzeng.final.bam 即可！！！把上面的表格可视化，就是文章最开头的figure。但是很明显公司给我的各个指标均高于我自己算出来的！尤其是其中几个染色体的coverage非常差。当然平均测序深度，我在这里选择的是整个染色体的长度作为分母，对于那些覆盖度很差的染色体，平均测序深度就被被拉低。所以我起初猜想是不是问题出在我用的是samtools的mpileup命令，而不是depth命令！（因为我以前从来没有如此细致的去比较它们的差别，其实这这个命令的确有差别，但是对全基因组层面的统计指标几乎没什么影响）

下面的表格，是我用depth命令的结果，而且平均测序深度我选择被覆盖到的染色体长度作为分母，所以看到测序深度有些许提升，但是有几条染色体的覆盖度堪忧。与公司给我的报告不符合！

先不要急着怪公司，请听下回分解

这个问题我会详细讲解，请关注后面的帖子：

或者不用重复造轮子，bedtools有这个命令：http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/content/tools/genomecov.html

而且Qualimap软件也可以做到，后面我们会讲到！

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参考：

http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=17438

https://www.biostars.org/p/218049/

https://www.biostars.org/p/3326/

http://www.danielecook.com/calculate-depth-coverage-bam-file/

Should Samtools Pileup Be Performed On Uniquely Mapped Reads Or All The Reads?

Genomic Coverage - Samtool's undocumented "depth" verses the poorly documented pileup.

Discrepancy In Samtools Mpileup/Depth And Bedtools Genomecoveragebed Counts

去除PCR duplication的reads用samtools或者picard均可，对单端测序数据来说，去除掉比对到同一个基因组坐标的reads即可，当然要保证比对的flag是一致的。但是单端测序比对flag情况只有0,4,16，flag很容易一致。然而对于双端测序来说，去除PCR重复不仅仅需要它们比对到的染色体起始终止位置相同，更重要的是flag的一致。在双端测序里面存在着一大堆的flag情况，如果flag不一致，比对到基因组同一坐标也不会认为是PCR的duplication。还有要考虑插入片段的大小，就是第9列，如果第9列不一致，这个双端测序也不会被当做PCR duplication而去除。

很明显，公司给我的bam文件里面并没有去除pcr duplicate，比如下面：

这3条reads虽然都比对到了1号染色体的第13145个碱基的位置，但是尾号为63261的reads跟另外两个的flag不一致，所以它被保留下来，而另外两条reads虽然flag一致，但是第九列插入片段不一致，也不会被当做duplication被去除。

下面这种情况才是需要去除的PCR duplication，而且它们的flag是1017，代表它们的另一端read并没有成功比对。

（请务必反复看这个示意图，并且自己找bam文件来理解我说的这段话）

而且他们给我的报告里面提到过有15%的duplication情况，我用Qualimap软件可视化如下：

可以看到大部分情况是duplicate一次，很少有多次重复的。

那么为什么要去除这个duplication呢？主要是因为在call snp的时候，如果某个变异位点的变异碱基都是来自于PCR重复，而我们却认为它深度足够判断是真的变异位点，这个结论其实有很大可能是假阳性。

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公司给我的bam数据是把有效测序数据通过 BWA（Li H et al.）比对到参考基因组 (b37)，这是目前使用率很高的一个软件。在比对过程中，如果一个或一对 read(s) 在基因上可以有多个比对位置，BWA 的处理策略是从中选择一个最好的，如果有两个或以上最好的比对位置，则从中随机选择一个。这种多重比对（multiple hits）的处理对 SNP、INDEL 以及 CNV 等的检测有重要影响。

通常检测 SNP 或 INDEL 的时候要使用高质量的比对结果(alignment)， 即比对质量值[MAPQ]大于0或更高。

前面我们详细讲了sam文件格式，在sam文件的第五列是MAPQ值，对某些软件，比如BWA，直接通过它就可以区分unique mapping和mutiple mapping的情况，就是判断这条reads是否只比对到参考基因组的唯一的位点。所以对于这种情况下的sam文件，提取unique mapping非常简单，用samtools view -q 1 （过滤掉MAPQ值低于1的情况）。

正好公司提供的bam文件就是这样的情况，因为他们在使用bwa这个软件来把测序数据比对到参考基因组的时候并没有加上-a这个参数，那么输出的sam文件里面，bwa会对每一个有multiple mapping情况的reads的MAPQ值设置为0，所以提前multiple mapping的reads是非常容易的。

但其它软件，其它参数产生的sam比对文件，如果我们要提取multiple mapping的reads就不那么容易了，因为MAPQ为0，并不一定就是multiple mapping。如下：

可以看到上面很多序列都是150M，但是mapping的quality都是0，也有很多其它比对序列也是quality为0，它们在IGV显示如下：

每一个矩形箭头都是一条比对好的reads，如果是白色的说明比对质量值为0，如果是灰色的，说明是正常的reads。

那么这个地方为什么会集中一大堆的multiple mapping的reads呢？

一些软件在根据bam文件来选择变异位点的时候会忽略掉这些mapping quality为0的reads。

也就是说对于这部分软件来说，这些mapping quality为0的reads是没有用的，相当于损失掉了，假设整体基因组的覆盖深度是很平均的，那这些MAPQ为0的位置的覆盖深度相当于降低了。这很有可能影响SNV位点的可信度。

那有multiple mapping情况的reads都集中在基因组的哪些区域呢？在哪些基因附近呢？

我们可以先用公司提供的bam文件提取出MAPQ为0的reads[里面包含大多数 multiple reads]，看一下大致的分布，后面再用我自己比对得到的bam作进更加准确的分析。

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而左右端测序数据比对到不同染色体的情况，比较有意义，可能是融合基因，也可能是基因之间本来就相似性很大。

在sam文件里面左右端测序数据比对到不同染色体情况如下所示：

提取的脚本很简单是：samtools view P_jmzeng.final.bam|perl -alne '{print if $F[6] ne "="}'  >unpaired.sam  可以看到这样的情况还是挺多的，14G的sam文件，当然，里面有非常多的是没有比对上的，下面的统计可以看出。

可以用命令 cut -f 3,7 unpaired.sam |sort |uniq -c 简单统计一下

先提取出来，我们后面再讲如何应用这个数据。

三种具有代表性的肿瘤融合基因BCR-ABL、SLC45A3-ELK4 和. PAX3-FOXO1

融合基因（英语：Fusion gene）是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为一个新的基因的过程。 其有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果。

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既然是从我的血液里面提取到的DNA进行测序的，那么理论上测序仪出来的所有测序reads都应该是我的，也应该都可以比对到人类的参考基因组，但是实际过程中的确存在着未必对上的数据。

现有人类基因组毕竟只是个参考，也许我有某些独特的DNA序列呢？而且也不一定测序数据就都是人类的，也许我血液里面会有那么些微不纯粹呢？也有可能是某些片段变异的太多了，超过了常见的比对软件的承受能力，可以试用SHRIMP这个软件来提取一下。当然，这不是本讲的重点。

前面我们已经详细讲解了sam文件的格式，就是为了给这个做铺垫，如果还不清楚的，可以回过头再仔细阅读(http://genome.sph.umich.edu/wiki/SAM)。sam格式文件的第3和第7列，可以用来判断某条reads是否比对成功到了基因组的染色体，左右两条reads是否比对到同一条染色体。有两个方法可以提取未比对成功的测序数据，sam文件的第3列是*的(如果是PE数据，需要考虑第6,7列)，或者sam文件的flag标签包含0x4的，代码如下：

虽然上面两个方法得到的结果是一模一样的，但是这个perl脚本运行速度远远比不上上面的samtools自带的参数。

sam文件的说明书里面有这样一句话;https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

An unmapped segment without coordinate has a ‘*’ at this field.  However, an unmapped segment may also have an ordinary coordinate such that it can be placed at a desired position after sorting. If RNAME is ‘*’, no assumptions can be made about POS and CIGAR.

（其实也不一定要自己写脚本，我们前面讲到的用来把巨大的bam文件按照染色体分割的小软件bamtools也可以完成这个需求，用 bamtools -split -in my.bam -mapped 即可！）

小写的f是提取，大写的F是过滤。因为我们测序数据的双端的，那么sam文件的第3列是reads1的比对情况，第6列是reads2的比对情况。所以未比对成功的测序数据可以分成3类，仅reads1，仅reads2，和两端reads都没有比对成功。

也可以用下面的代码分步提取这3类未比对成功的reads:

可以简单的统计一下未比对成功的reads有多少：

结果如下

如果对bamtools软件的结果来统计：

samtools view P_jmzeng.final.REF_unmapped.bam |cut -f 3,7 |sort |uniq -c >unmapped.counts

得到的结果只有7492014 * * 说明它只考虑了PE reads均为比对成功的情况。

很奇怪，看起来我的未比对成功的测序数据里面竟然没有右端成功，而左端失败的情况，这个我没办法解释。 我也还需要学习才能搞明白这件事。

(其实之前我也搞错了，如果PE reads的左右两端均没有比对成功，那么第3,6,7列都是*，4，5，8，9都是0，第2列flag只有77,141这两种情况。(77代表PE,而且PE的两条reads都是unmanned的，141跟77一样，只是它们分别指代unmanned的的PE的reads的两端,结合https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html来理解)

如果是左右两端reads只有一个比对成功，另一个reads没有比对上，如果是read1比对了，read2失败了，那么第3列应该是read1的染色体，第7列应该是*号表明read2没有比对成功。同理，如果read2比对成功，read1失败，按照道理，我们应该看得第7列有染色体，第3列是*号，但是我们在提取的unmapped文件里面，没有发现这种情况。

但其实不管是左端还是右端，第3列都是有染色体的，第7列是=号，但这并不能说明左端跟右端有着同样的比对结果。而第6列CIGAR是*，这个才是判断左右端是否匹配失败的标准。

sam文件的说明书里面有这样一句话;https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf

对于第6列CIGAR来说，An unmapped segment without coordinate has a ‘*’ at this field. However, an unmapped segment may also have an ordinary coordinate such that it can be placed at a desired position after sorting. If RNAME is ‘*’, no assumptions can be made about POS and CIGAR.

这也就是我为什么没有发现第7列有染色体，第3列是*号的reads。即使PE reads的右端匹配，左端未匹配，它只会把这个read比对的染色体写在第3列，而不是第7列！所以说要想探究它是左端还是右端未比对成功，得看flag。

这样就提取出来了未比对的测序数据，但是还需要做进一步分析，看看这些reads究竟是何方大神！具体要在第25讲之后了，敬请期待！

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