HISAT全称为Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts，由约翰霍普金斯大学开发。它取代Bowtie/TopHat程序，能够将RNA-Seq的读取与基因组进行快速比对。这项成果发表在3月9日的《Nature Methods》上。

HISAT利用大量FM索引，以覆盖整个基因组。以人类基因组为例，它需要48,000个索引，每个索引代表~64,000 bp的基因组区域。这些小的索引结合几种比对策略，实现了RNA-Seq读取的高效比对，特别是那些跨越多个外显子的读取。尽管它利用大量索引，但HISAT只需要4.3 GB的内存。这种应用程序支持任何规模的基因组，包括那些超过40亿个碱基的。

HISAT软件可从以下地址获取：http://ccb.jhu.edu/software/hisat/index.shtml。

首先，我们安装这个软件！

Wget http://ccb.jhu.edu/software/hisat/downloads/hisat-0.1.5-beta-source.zip

官网下载的是源码包，需要make一下，make之后目录下面就多了很多程序，绿色的那些都是，看起来是不是很眼熟呀！！！

哈哈，这完全就是bowtie的模拟版本！！！

也可以从github里面下载，wget https://codeload.github.com/infphilo/hisat/zip/master

下载后直接解压即可使用啦。当然这个软件本身也有着详尽的说明书

http://ccb.jhu.edu/software/hisat/manual.shtml

然后就是准备数据，它跟tophat一样的功能。就是把用RNA-seq方法测序得到的fastq文件比对到参考基因组上面，所以就准这两个文件了哦

接下来是运行程序！

说明书上面写着分成两个步骤，构建索引和比对。

这个软件包模仿bowtie自带了一个example数据，而且它的说明书也是针对于那个example来的，我也简单运行一下。

$HISAT_HOME/hisat-build $HISAT_HOME/example/reference/22_20-21M.fa 22_20-21M_hisat

构建索引的命令如上，跟bowtie一样我修改了一下

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build 22_20-21M.fa  my_hisat_index

连日志都跟bowtie一模一样，哈哈，可以看到我们的这个参考fasta文件 22_20-21M.fa 就变成索引文件啦，索引还是很多的！

然后就是比对咯，还是跟bowtie一样

$HISAT_HOME/hisat -x 22_20-21M_hisat -U $HISAT_HOME/example/reads/reads_1.fq -S eg1.sam

我的命令是

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat -x  my_hisat_index -U ../reads/reads_1.fq  -S reads1.sam

1000 reads; of these:

1000 (100.00%) were unpaired; of these:

0 (0.00%) aligned 0 times

1000 (100.00%) aligned exactly 1 time

0 (0.00%) aligned >1 times

100.00% overall alignment rate

哈哈，到这里。这个软件就运行完毕啦！！！是不是非常简单，只有你会用bowtie，这个就没有问题。当然啦，软件还是有很多细节是需要调整的。我下面就简单讲一个实际的例子哈！

首先，我用了1.5小时把4.6G的小鼠基因组构建了索引

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat-build  Mus_musculus.GRCm38.fa.fa mouse_hisat_index

然后对我的四个测序文件进行比对。

for i in *fq

do

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-0.1.5-beta/hisat  -x  /home/jmzeng/hoston/mouse/mouse_hisat_index  \

-p 30 -U  $i.trimmed.single  -S ./hisat_out/${i%.*}.sam

done

它运行的速度的确要比tophat快好多，太可怕的速度！！！！至于是否多消耗了内存我就没有看了

4.6G的小鼠，5G的测序数据，我只用了五个核，居然十分钟就跑完了！

然后听群友说是因为没有加 --known-splicesite-infile <path>这个参数的原因，没有用gtf文件来指导我们的RNA数据的比对，这样是不对的！

需要用下面这个脚本把gtf文件处理一下，然后导入什么那个参数来指导RNA比对。

extract_splice_sites.py genes.gtf > splicesites.txt

但是我报错了，错误很奇怪，没解决，但是我换了个 extract_splice_sites.py  程序，就可以运行啦！之前是HISAT 0.1.5-beta release 2/25/2015里面的python程序，后来我换做了github里面的就可以啦！

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/hisat-master/extract_splice_sites.py Mus_musculus.GRCm38.79.gtf >mouse_splicesites.txt

21192819 reads; of these:
21192819 (100.00%) were unpaired; of these:
14236834 (67.18%) aligned 0 times
5437800 (25.66%) aligned exactly 1 time
1518185 (7.16%) aligned >1 times

感觉没有变化，不知道为什么？

21192819 reads; of these:

21192819 (100.00%) were unpaired; of these:

14236838 (67.18%) aligned 0 times

5437793 (25.66%) aligned exactly 1 time

1518188 (7.16%) aligned >1 times

32.82% overall alignment rate

发表这个软件的文献本身也把这个软件跟其它软件做了详尽的对比

http://www.nature.com/nmeth/journal/v12/n4/full/nmeth.3317.html

参考：http://www.plob.org/2015/03/20/8980.html

http://nextgenseek.com/2015/03/hisat-a-fast-and-memory-lean-rna-seq-aligner/

首先当然是下载软件啦！

两个地方可以下载，一个是谷歌code中心，被墙啦，另一个是github，我的最爱。

wget https://codeload.github.com/alexdobin/STAR/zip/master

解压即可使用啦，其中程序在bin目录下面，根据自己的平台调用即可！

然后doc里面还有个pdf的说明文档，写的非常清楚，我也是看着那个文档学的这个软件！

接下来就是准备数据啦！

既然是类似于tophat一样的比对软件，当然是准备参考基因组和测序数据咯，毫无悬念。

然后 该软件也给出了一些测试数据

ftp://ftp2.cshl.edu/gingeraslab/tracks/STARrelease/2.1.4/

然后就是运行程序的命令！

分为两个步骤：首先构建索引，然后比对即可，中间的参数根据具体需要可以细调！

构建索引时候，软件说明书给的例子是

The basic options to generate genome indices are as follows:
--runThreadN NumberOfThreads
--runMode genomeGenerate
--genomeDir /path/to/genomeDir
--genomeFastaFiles /path/to/genome/fasta1 /path/to/genome/fasta2 ...
--sjdbGTFfile /path/to/annotations.gtf
--sjdbOverhang ReadLength-1

我模仿了一下。对我从ensembl ftp里面下载的老鼠基因组构建了索引

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/STAR-master/bin/Linux_x86_64/STAR  \

--runThreadN 30 #我的服务器还比较大，可以使用30个CPU  \

--runMode genomeGenerate \

--genomeDir  /home/jmzeng/hoston/mouse/STAR-mouse #构建好的索引放在这个目录 \

--genomeFastaFiles  /home/jmzeng/hoston/mouse/Mus_musculus.GRCm38.fa.fa \

--sjdbGTFfile /home/jmzeng/hoston/mouse/Mus_musculus.GRCm38.79.gtf \

--sjdbOverhang 284   #我的测序数据长短不一，最长的是285bp

当然注释的地方你要删除掉才行呀，因为cpu用的比较多。

算一算时间，对4.6G的小鼠基因组来说，半个小时算是非常快的了！Bowtie2的index要搞两个多小时。

然后就是比对咯。这也是很简单的，软件说明书给的例子是

The basic options to run a mapping job are as follows:
--runThreadN NumberOfThreads
--genomeDir /path/to/genomeDir
--readFilesIn /path/to/read1 [/path/to/read2]

我稍微理解了一下参数，然后写出了自己的命令。

fq=740WT1.fq.trimmed.single

mkdir  740WT1_star

/home/jmzeng/hoston/RNA-soft/STAR-master/bin/Linux_x86_64/STAR  \

--runThreadN 20  \

--genomeDir  /home/jmzeng/hoston/mouse/STAR-mouse   \

--readFilesIn  $fq \

--outFileNamePrefix  ./740WT1_star/740WT1

如果输出文件需要被cufflinks套装软件继续使用。就需要用一下参数

Cufflinks/Cuffdiff require spliced alignments with XS strand attribute, which STAR will generate with --outSAMstrandField intronMotif option.

还有--outSAMtype参数可以修改输出比对文件格式，可以是sam也可以是bam，可以是sort好的，也可以是不sort的。

最后是输出文件解读咯！

其实没什么好解读的，输出反正就是sam类似的比对文件咯，如果还有其它文件，需要自己好好解读说明书啦。我就不废话了！

值得一提的是，该程序提供了2次map的建议

The basic idea is to run 1st pass of STAR mapping with the usual parameters , then collect the junctions detected in the first pass, and use them as ”annotated” junctions for the 2nd pass mapping.

在对RNA-seq做snp-calling的时候可以用到，尤其是GATK官方还给出了教程，大家可以好好学习学习！

http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/article?id=3891

为什么要用这个软件？：因为转录组reads比对到基因组reads用bwa和bowtie的效果都不够好，所以我们选择tophat

它做了什么？：tophat把测序的转录组的原始reads比对到了参考基因组上面，并且输出了bam（二进制的sam）文件比对结果给我们。（fastq--->bam）

一：下载安装该软件

其实一般的生信服务器自然会有高手给安装好了，你只需调用即可，这里我给大家演示一下如何安装。

wget   http://ccb.jhu.edu/software/tophat/downloads/tophat-2.0.13.Linux_x86_64.tar.gz

我这里简单下载二进制版本的，直接解压即可使用，里面除了tophat之外，还有好几个小工具，也是挺实用的。

二：准备数据

数据当然是测序的转录组的原始reads啦，fastq格式的

还有人的参考基因组，这里选择人的hg19，很容易就下载了，bowtie官网里面有下载并且索引好了所有文件。如果你是自己下载的hg19，需要用bowtie先进行索引，见我的bowtie简单使用教程

三：运行命令

不需要看那么多的参数，首先要能用

/home/jmzeng/bio-soft/tophat-2.0.13.Linux_x86_64/tophat2 /home/jmzeng/ref-database/hg19 case1.fq

拆开看就是tophat2   hg19  case1.fq    即可，不需要设置任何参数，等需要优化的时候再去思考参数的意义，我这里是单端测序的命令。

不过我的习惯是用脚本解决问题，一定要批量化运行的，我设置了30个CPU，也设置了输出目录，还加上了一个转录本

也许是要等明天才能看结果啦

好像用了30个cpu跑的很快，每个两个多小时就跑完啦

四：输出文件解读

这三个文件夹里面就输出文件，每个样本一个输出文件夹，

任意进入一个文件夹可以看到

通常，我们只需要那个accepted_hits.bam文件，是我们的测序reads成功比对到hg19什么的比对情况。

接下来就可以用很多软件来处理这个bam文件了