这个软件设计就是为了illumina的测序数据的，因为它自带的adaptor文件有限，上图可以看到！而且一般只去除TruSeq Universal Adapter 这个接头，运行的时候，不报错才算是成功的！

官网有例子，很简单的：http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic

Paired End:

java -jar trimmomatic-0.35.jar PE -phred33 input_forward.fq.gz input_reverse.fq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36 ## 所以只需要把参数放对位置即可！

This will perform the following:

一般就使用这个默认参数就好啦，处理的时间会有一点慢，我取了10个线程也得十几分钟才搞定2G的fq.gz压缩格式的测序文件，文件的log日志如下：

TrimmomaticPE: Started with arguments:

-threads 10 -phred33 -trimlog tmp.log CHG006373_R1.fastq.gz CHG006373_R2.fastq.gz output_forward_paired.fq.gz output_forward_unpaired.fq.gz output_reverse_paired.fq.gz output_reverse_unpaired.fq.gz ILLUMINACLIP:/home/jmzeng//biosoft/trimmomatic/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:10 TRAILING:20 SLIDINGWINDOW:4:25 MINLEN:36

Using PrefixPair: 'TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT' and 'GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT'

ILLUMINACLIP: Using 1 prefix pairs, 0 forward/reverse sequences, 0 forward only sequences, 0 reverse only sequences

Input Read Pairs: 21427010 Both Surviving: 14507723 (67.71%) Forward Only Surviving: 5297811 (24.72%) Reverse Only Surviving: 375547 (1.75%) Dropped: 1245929 (5.81%)

TrimmomaticPE: Completed successfully

记住指定接头文件一定要用全路径哦！！！

可以看到它使用了自带的文件TruSeq3-PE.fa里面的接头 TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT其实只是 TruSeq Universal Adapter (可以在https://github.com/csf-ngs/fastqc/blob/master/Contaminants/contaminant_list.txt 找到接头信息)的后半段，直接在R1测序文件里面搜索可以看到，距离AAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTT这样的字符串和它的 接头 TACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT之间还有序列：

比如我们拿第一个序列举例，可以看到第一条序列被trimmomatic丢到了output_forward_unpaired.fq.gz，它就懒得给它去除接头了，因为右端序列更可怜！

检查文件，发现有的地方是根据质量值来去除的，因为跟接头没有半毛钱关系！

因为它是接头和低质量碱基一起去除，我很难探究它到底是如何去除接头的，非常郁闷，但是它对illumina的数据效果非常好！因为去除的百分比很高。

这个lumi包的使用代码和说明书都有，按部就班的学一遍就好了。

如果仅仅是分析数据，那么并不难，但是每个分析步骤后面都隐含着一系列的统计学方法，想彻底搞清楚他它们， 就很难了。

data(example.lumi)

lumi.N.Q <- lumiExpresso(example.lumi)

dataMatrix <- exprs(lumi.N.Q)

重点就是得到表达矩阵，它封装好了一个函数，lumiExpresso可以直接处理LumiBatch对象，这个函数结合了,N,T,B,Q(normalization,transformation,backgroud correction,qulity control)四个步骤，其中Q这个步骤又包括8种统计学图片。在该包的文章有详细说明：http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/24/13/1547.full 

而 LumiBatch 对象是通过 lumiR.batch 读取的芯片文件被Illumina Bead Studio toolkit 处理的结果，也就是通常我们从公司或者GEO下载的数据( level 3 的 process data)，如下所示：

这个包用的测试文件Barnes_gene_profile.txt可以在http://www.chibi.ubc.ca/wp-content/uploads/2013/02/ 下载。

rm(list=ls())

library(lumi)

# setwd('G:/array/illumina-beadseed-v4/lumi_example')

# fileName <- 'Barnes_gene_profile.txt' # Not Run

## 首先是从illumina的芯片结果文件，自己用R的lumi包来获取表达矩阵。

setwd('G:/array/illumina-beadseed-v4/GSE30669')

fileName <- 'GSE30669_HEK_Sample_Probe_Profile.txt' # Not Run

x.lumi <- lumiR.batch(fileName) ##, sampleInfoFile='sampleInfo.txt')

pData(phenoData(x.lumi))

## Do all the default preprocessing in one step

lumi.N.Q <- lumiExpresso(x.lumi)

### retrieve normalized data

dataMatrix <- exprs(lumi.N.Q)

## 下面是从GEO里面下载表达矩阵

rm(list=ls())

library(GEOquery)

library(limma)

GSE30669 <- getGEO('GSE30669', destdir=".",getGPL = F)

exprSet=exprs(GSE30669[[1]])

GSE30669[[1]]

pdata=pData(GSE30669[[1]])

exprSet=exprs(GSE30669[[1]])

很明显可以看到前面得到的dataMatrix 和后面得到的 exprSet 都是我们想要的表达矩阵

illumina是大厂家，所以芯片包括人类的，小鼠以及大鼠的，然后对于人来说，经历了V1~V4的进化过程，最新版是 V4。

GEO里面是这样介绍illumina bead V4这个芯片的：

The HumanHT-12 v4 Expression BeadChip provides high throughput processing of 12 samples per BeadChip without the need for expensive, specialized automation. The BeadChip is designed to support flexible usage across a wide-spectrum of experiments.

可以在官网下载芯片探针的详情，manifest数据文件：http://support.illumina.com/array/array_kits/humanht-12_v4_expression_beadchip_kit/downloads.html 这些文件写清楚了芯片用的探针的详情，包括使用了哪些control探针，主要是给它自己的BeadStudio 软件来使用的。

NCBI的GEO也提供大批量的公共数据：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GPL10558

芯片厂家illumina本身提供数据处理软件BeadStudio, GenomeStudio，在R/bioconductor上面也有开源的包做同样的事情，Illuminaio ，beadarray，lumi

数据的前期处理有3个层次，都在bioconductor有对应的包可以来处理

Data can be in raw form, where pixel-level data are available from TIFF images, allowing the complete data processing pipeline, including image analysis, to be carried out in R. 这种图片格式的数据，基本上没有人愿意去开始处理的，TIFF格式的图片压缩包，在BeadArrayUseCases包里面附带有一个测试数据

The next level, referred to as bead-level, refers to the availability of intensity and location information for individual beads. In this format, a given probe will have a variable number of replicate intensities per sample. Processed data, where replicate intensities have been summarized and outliers removed to give a mean, a measure of variability, and a number of observations per probe in each sample, is the most commonly available format.

数据处理流程如下：

其实对芯片数据处理最重要的过程，就是如何做QC以及拿到表达量矩阵，后面的差异分析，功能富集分析其实是大同小异的。我比较喜欢用bioconductor包，会讲如何用 lumi包来处理这个芯片数据。