bedtools multicov和htseq-count都可以用来对基因和转录本的表达量的计算！！！

我们总共有四个样本，已经比对到小鼠的mm9基因组上面了，数据大小如下

然后对基因和转录本计数需要一些额外的信息，即各个基因及转录本的位置信息，gtf文件需要在UCSC等各大数据库下载

然后我们制作一个config文件配置我们的数据地址

cat sample_bam.config 可以看到文件内容如下

/data/mouse/ptan/740WT1.bam

/data/mouse/ptan/741WT2.bam

/data/mouse/ptan/742KO1.bam

/data/mouse/ptan/743KO2.bam

几个批处理文件名及内容分别如下

bedtools_multicov.sh  bedtools_multicov_transcript.sh  htseq.sh  htseq_transcript.sh

while read id

do

echo $id

new=`echo $id |cut -d"/" -f 5`

echo $new

bedtools multicov -bams $id -bed /data/mouse/mouse_mm9_gene.bed  > $new.gene.bedtools_multicov.count

done <$1

while read id

do

echo $id

new=`echo $id |cut -d"/" -f 5`

echo $new

bedtools multicov -bams $id -bed /data/mouse/mouse_mm9_transcript.bed  > $new.transcript.bedtools_multicov.count

done <$1

while read id

do

echo $id

new=`echo $id |cut -d"/" -f 5`

htseq-count -f bam $id /data/mouse/Mus_musculus.NCBIM37.67.gtf.chr  > $new.gene.htseq.count

done <$1

while read id

do

echo $id

new=`echo $id |cut -d"/" -f 5`

htseq-count -f bam --idattr transcript_id $id /data/mouse/Mus_musculus.NCBIM37.67.gtf.chr  > $new.transcript.htseq.count

done <$1

批量运行这些程序后就能对它们分别分情况进行计数，也能比较这两种计数方法的区别！

可以看出区别还是很大的！！！

我肯定没搞懂它们的原理，这完全就不一样，已经不是区别的问题了！！！

对于每个个体输出的计数文件，接下来就可以用DESeq等包来进行差异基因分析啦！

一：下载安装该软件

下载htseq这个python模块安装解压包，依赖于很多python的其它安装包及库，模块，我最讨厌python了，在有些电脑上特别难安装，而且服务器还有权限的问题。

解压进入该目录，输入 python setup.py   install  --user  记住，是- - 而不是—

这样只是把这个软件安装到自己的目录

安装完毕后，会出现这两个程序，在自己的python库里面，可以直接调用这两个程序的，我这里它们的路径是 .local/bin ，很奇怪的一个路径，我也是用find命令才找到的

我在这里主要讲解，在这里调用这个命令来进行操作，直接把它当做一个程序来使用，而不是仅仅当做是python里面的一个模块调用，不需要import HTseq。

二：准备数据

输入文件

输入为sam格式的文件，如果是paired-end数据必须按照reads名称排序（sort by name）。先用samtools先对bam文件（tophat2的输出结果为bam）排序，再转换为sam。

  命令：samtools sort -n file.bam #sort bam by name

        samtools view -h bamfile.bam>samfile.sam

其实可以是任意的sam文件，在这里我主要演示我自己跑tophat出来的bam文件转为的sam文件，就是三个RNA数据的结果

    这样得到的三个sam文件特别大，bam文件是sam的二进制文件才三五个G，到了sam格式就是十几二十个G了，其实完全没必要自己把它转为sam文件，因为htseq有个参数-f可以控制输入格式是bam文件。

三：运行命令

官方的Usage：htseq-count [options] <sam_file> <gff_file>

HTSeq的作者Simon Anders建议使用ENSEMBL的gtf文件。  但是如果用了ensembl的，那么之前tophat就应该用ensembl的gtf作为参考来比对

也可以使用python -m HTSeq.scripts.count instead of htseq-count

我的命令是：

 /home/jmzeng/.local/bin/htseq-count case1.sam   /home/jmzeng/ref-database/hg19.gtf

但是我还是喜欢批处理来运行，一次性解决所有的bam文件计数问题

出来得到的日志是这样的

约等待几个小时就OK啦

四：输出文件解读

共两万多个基因，每个基因一行，基因名加上count数

可以head看一下里面的内容如下

tips; 1，你可以用--idattr transcript_id来指定程序计算转录本而不是基因，但是这样会导致共有转录本重合地方太多

参考：

安装http://pgfe.umassmed.edu/ou/archives/2549

操作htseq的方法http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/tour.html

http://chenxindayangzhou.blog.163.com/blog/static/2809209220137234916786/

另外一个操作方法http://www-huber.embl.de/users/anders/HTSeq/doc/count.html