结果是这样的

我们接下来用另外一种方法来做富集分析，顺便检验一下，是不是超几何分布统计检验的富集分析方法就是最好的呢？

这种方法是-重抽样+主成分分析

大概的原理是，比如对上图中的，04380这条pathway来说，总共有128个基因，那么我从原来的表达矩阵里面随机抽取128个基因的表达矩阵做主成分分析，并且抽取一千次，每次主成分分析都可以得到第一主成分的贡献度值。那么，当我并不是随机抽取的时候，我就抽04380这条pathway的128个基因，也做主成分分析，并且计算得到第一主成分分析的重要性值。我们看看这个值，跟随机抽1000次得到的值差别大不大。

这时候就需要用到表达矩阵啦！

setwd("D:\\my_tutorial\\补\\用limma包对芯片数据做差异分析")

exprSet=read.table("GSE63067_series_matrix.txt.gz",comment.char = "!",stringsAsFactors=F,header=T)

rownames(exprSet)=exprSet[,1]

exprSet=exprSet[,-1]

我们根据ncbi里面对GSE63067的介绍可以知道，对应NASH和normal的样本的ID号，就可以提取我们需要的表达矩阵

把前面两属于Steatosis的样本去掉即可，exprSet=exprSet[,-c(1:2)]

然后再把芯片探针的id转换成entrez id

exprSet=exprSet[,-c(1:2)]

library(hgu133plus2.db)

library(annotate)

platformDB="hgu133plus2.db";

probeset <- rownames(exprSet)

rowMeans <- rowMeans(exprSet)

EGID <- as.numeric(lookUp(probeset, platformDB, "ENTREZID"))

match_row=aggregate(rowMeans,by=list(EGID),max)

colnames(match_row)=c("EGID","rowMeans")

dat=data.frame(EGID,rowMeans,probeset)

tmp_prob=merge(dat,match_row,by=c("EGID","rowMeans"))

relevantProbesets=as.character(tmp_prob$probeset)

length(relevantProbesets) #hgu133plus2.db  20156

exprSet=exprSet[relevantProbesets,]

EGID_name=as.numeric(lookUp(relevantProbesets, platformDB, "ENTREZID"))

rownames(exprSet)=as.character(EGID_name)

d=exprSet

最后得到表达矩阵表格

我们首先得到1000次随机挑选128个基因的表达矩阵的主成分分析，第一主成分贡献度值。

gene128=sapply(1:1000,function(y) {

dat=t(d[sample(row.names(d), 128, replace=TRUE), ]);

round(100*summary(fast.prcomp(dat))$importance[2,1],2)

}

)

很快就能得到结果，可以看到数据如下

>  summary(gene128)

Min. 1st Qu.  Median    Mean 3rd Qu.    Max.

19.1    25.8    28.8    29.8    32.5    59.7

那么接下来我们挑选这个04380这条pathway特有128个基因来算第一主成分贡献度值

path_04380_gene=intersect(rownames(d),as.character(Path2GeneID[['04380']]))

dat=t(d[path_04380_gene,]);

round(100*summary(fast.prcomp(dat))$importance[2,1],2)

得到的值是38.83，然后看看我们的这个38.83在之前随机得到的1000个数里面是否正常，就按照正态分布检验来算

1-pnorm((38.83-mean(gene128))/sd(gene128))

[1] 0.0625

可以看到已经非常显著的不正常了，可以说明这条通路被富集了。

至少说明超几何分布检验的方法得到的富集分析结果跟我们这次的重抽样+主成分分析结果是一致的，当然，也有不一致的，不然就不用发明一种新的方法了。

如果写一个循环同样可以检验所有的通路，但是这样就不需要事先准备好差异基因啦！！！这是这个分析方法的特点！

主成分分析是为了简化变量的个数。
我这里不涉及到任何高级统计知识来简单讲解一下主成分分析，首先我们用下面的代码随机创造一个矩阵：

options(digits = 2)
x=c(rnorm(5),rnorm(5)+4)
y=3*c(rnorm(5),rnorm(5)+4)
dat=rbind(x,y,a=0.1*x,b=0.2*x,c=0.3*x,o=0.1*y,p=0.2*y,q=0.3*y)
colnames(dat)=paste('s',1:10,sep="")
dat
library(gmodels)
pca=fast.prcomp(t(dat))
pca
summary(pca)$importance
biplot(pca, cex=c(1.3, 1.2));

那么根据我们的创建规则，其实a,b,c,o,p,q变量跟x,y是有关系的，而主成分分析，就是找出这个关系：a=0.1x,b=0.2x,c=0.3x,o=0.1y,p=0.2y,q=0.3y

如果不用主成分分析，我们需要把所有的变量进行两两组合，计算量太大了
我们直接gmodels用这个保留里面的函数fast.prcomp来对dat矩阵做主成分分析，分析结果如下：

主成分分析就是降维，本来应该有8个变量，现在我们变成了8个主成分，而一般前面的几个主成分就能解释所有的数据了。
比如我们看这个PC1,PC2，根据结果画出下面的图，把我们的矩阵区分的特别清楚。

如果想继续了解其中的统计学原理，请自行看下面的ppt
http://www.cs.otago.ac.nz/cosc453/student_tutorials/principal_components.pdf
https://www.cs.princeton.edu/picasso/mats/PCA-Tutorial-Intuition_jp.pdf
http://www.cs.umd.edu/~samir/498/PCA.pdf
http://www.yale.edu/ceo/Documentation/PCA_Outline.pdf
http://people.tamu.edu/~alawing/materials/ESSM689/pca.pdf （R相关）
http://www2.dc.ufscar.br/~cesar.souza/publications/pca-tutorial.pdf （2012）
中文的更多啦，我就不贴地址啦