2012-新英格兰-4个ccRCC病人的26个肿瘤部位

Endesfelder, D., Math, D., Gronroos, E., Ph, D., Martinez, P., Ph, D., … Ph, D. (2012). Intratumor Heterogeneity and Branched Evolution Revealed by Multiregion Sequencing. New England Journal of Medicine.
只有4个ccRCC病人，26个肿瘤组织测序，平均测序深度74而已，是clear cell renal cell carcinoma，取样如下：

说明了Branched tumor evolution，那些trunk突变更趋向于是标志物或者治疗靶点。

Genomics analyses from single tumor-biopsy specimens may underestimate the mutational burden of heterogeneous tumors. Reconstructing tumor clonal architectures and the identification of common mutations located in the trunk of the phylogenetic tree may contribute to more robust biomarkers and therapeutic approaches.

2014-science-7个NSCLC病人的25个部位

Voss, F. K., Ullrich, F., Münch, J., Lazarow, K., Lutter, D., Andrade-navarro, M. a, … Thomas, J. (2014). Spatial and temporal diversity in genomic instability processes defines lung cancer evolution. Science, 251(October). https://doi.org/10.1126/science.1252826
研究癌症是：non–small cell lung cancer (NSCLC) 实验测序策略是：25 spatially distinct regions from 7 operable NSCLCs and found evidence of branched evolution，如下图所示：
Total number of nonsilent mutations is provided below each tumor with percentage of heterogeneous mutations in brackets.
可以看到肿瘤异质性范围很大。

重要集中在对抽烟与否分组的病人进行不同的比较！
A large fraction of the genome had undergone alterations in all tumors, and genomic profiles were more similar within tumors than between different tumors

2014-science-11个LUAD病人的48个肿瘤部位

Bell, D. W., Settleman, J., Haber, D. A., Nussenzweig, A., Leibowitz, M. L., Pellman, D., … Human, N. (2014). Intratumor heterogeneity in localized lung adenocarcinomas delineated by multiregion sequencing. Science.
研究策略是：多位点取样的全外显子测序，48 tumor regions from 11 resected lung adenocarcinomas
同样是构建不同肿瘤部位的进化关系树，发现On average, 76% of all mutations were detected in all regions of the same tumors. 也就是说 肿瘤异质性很小。

跟2012的新英格兰发表的关于ccRCC研究不同的是，本研究说明了对肿瘤病人的单个部位采样是足够检查到大部分重要突变的。因为 ITH patterns may be different between cancer types. 需要更大样本量的临床队列来证实不同癌症不同亚型病人 异质性到底处于什么范围。
而且提高测序深度，肿瘤异质性会降低。

2015-oncogenesis-2个ESCC病人的11个肿瘤部位

Cao, W., Wu, W., Yan, M., Tian, F., Ma, C., Zhang, Q., … Biddle, F. G. (2015). Multiple region whole-exome sequencing reveals dramatically evolving intratumor genomic heterogeneity in esophageal squamous cell carcinoma. Oncogenesis, 4(11). https://doi.org/10.1038/oncsis.2015.34
研究策略：使用WES和(aCGH),技术对2个ESCC病人的11个肿瘤部位进行探索，其中芯片数据在GEO数据库，但是测序数据是在EGA。
同样说明是branching进化模型，但是ITH高达90%，其它癌症普遍都是30%~60%的异质性。

测序深度有点小：average target exome coverage of 50× in neoplastic DNA and 60 × in reference tissue using 76- bp paired-end reads
因为病人数量少，所以每个病人的受突变影响的基因集拿去GO/KEGG功能富集注释，
从SNV和CNV角度来量化，结果两个病人的：
In PtA, we classified 158 non-silent mutated genes into 17 trunk gene mutations, 54 branch gene mutations and 87 private mutations.
In PtB, 27 of 203 mutant genes were in the trunk, 76 mutant genes were located in the branch section and 100 genes were private mutations.

2015-cancer-Discovery-8个EAC患者的40个肿瘤部位

Murugaesu, N., Wilson, G. A., Birkbak, N. J., Watkins, T. B. K., McGranahan, N., Kumar, S., … Swanton, C. (2015). Tracking the genomic evolution of esophageal adenocarcinoma through neoadjuvant chemotherapy. Cancer Discovery, 5(8), 821–832. https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-15-0412
实验策略是：40 tumor regions from 8 EAC患者 ， before and after platinum-containing NAC.

用到了 intratumor heterogeneity (ITH) index.这个概念，而且看到了它跟NAC疗效显著相关。
也是和公共数据集比较 ：EAC tumors from the Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset

2015-nature-genetics-15个CRC病人的349个肿瘤样品

Sottoriva, A., Kang, H., Ma, Z., Graham, T. A., Salomon, M. P., Zhao, J., … Curtis, C. (2015). A Big Bang model of human colorectal tumor growth. Nature Genetics, 47(3), 209–216. https://doi.org/10.1038/ng.3214
研究策略是： 349 individual glands from 15 colorectal tumors，采样区分左右肿瘤部分，每个部分十多个样品测序，最后说明是大爆炸的进化模型。

包括WES, whole-exome sequencing; TS, targeted sequencing; 两个技术。
most detectable ITH occurs early after the transition to an advanced tumor.
Although private alterations continuously occur, only those that occur early have time for the corresponding clone to expand to a detectable size.
这个大爆炸模型的临床意义

2016-nature-genetics-13个ESCC病人的51个肿瘤样品

Hao, J. J., Lin, D. C., Dinh, H. Q., Mayakonda, A., Jiang, Y. Y., Chang, C., … Koeffler, H. P. (2016). Spatial intratumoral heterogeneity and temporal clonal evolution in esophageal squamous cell carcinoma. Nature Genetics, 48(12), 1500–1507. https://doi.org/10.1038/ng.3683
测序策略：13个ESCC病人的51个部位的WES数据，然后其中3个病人还是有了甲基化芯片。

平均是35.8%的异质性，跟前面的2个ESCC病人的11个肿瘤部位进行探索的研究的90%异质性相反，作者推测是测序深度的原因。
然后可以看到驱动突变的异质性要低。

2016-Molecular Oncology-3个膀胱癌转移患者的22个部位

Thomsen, M. B. H., Nordentoft, I., Lamy, P., Høyer, S., Vang, S., Hedegaard, J., … Dyrskjøt, L. (2016). Spatial and temporal clonal evolution during development of metastatic urothelial carcinoma. Molecular Oncology, 10(9), 1450–1460. https://doi.org/10.1016/j.molonc.2016.08.003
平均测序深度对肿瘤硬盘是68X (range 27-215X) ，对正常对照组织是167X (95-301X)，部分突变位点，做了超过3000的高深度测序验证。

因为样本量很小，所以作者重点放在了药物基因数据库，发现大部分可能的药物靶点突变都发生在branch，而不是trunk。

2016-Cancer-Research-8个皮肤癌的41个肿瘤部位

Harbst, K., Lauss, M., Cirenajwis, H., Isaksson, K., Rosengren, F., Törngren, T., … Jönsson, G. (2016). Multiregion whole-exome sequencing uncovers the genetic evolution and mutational heterogeneity of early-stage metastatic melanoma. Cancer Research, 76(16), 4765–4774. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-15-3476
发现3~38%的异质性，如下所示：

trunk和branch突变的突变特征比率有变化，就是突变频谱
不同部位的肿瘤的VAF的相关性散点图，还有DNA和RNA的VAF的散点图。
不同组学数据的肿瘤异质性并不一致。

2016-PLoS Genetics-9个CRC病人的75个肿瘤部位

Uchi, R., Takahashi, Y., Niida, A., Shimamura, T., Hirata, H., Sugimachi, K., … Mimori, K. (2016). Integrated Multiregional Analysis Proposing a New Model of Colorectal Cancer Evolution. PLoS Genetics, 12(2), 1–24. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005778
做WES和甲基化芯片，如下：

During this process generating ITH, mutation accumulations, CN alterations, and methylation alterations appeared to occur in a correlated manner.
提出中性进化模型。

2017新英格兰杂志的TRACERx计划关于NSCLC的研究

Jamal-Hanjani, M., Wilson, G. A., McGranahan, N., Birkbak, N. J., Watkins, T. B. K., Veeriah, S., … Swanton, C. (2017). Tracking the Evolution of Non–Small-Cell Lung Cancer. New England Journal of Medicine, 376(22), 2109–2121. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1616288
队列：100 early-stage NSCLC 病人（62 Men, 38 Women）的 327个肿瘤样品进行外显子测序，平均测序深度超400X
然后发现SNV的异质性比例是30% (range, 0.5 to 93) ，变化范围很大，生存分析不显著。
而CNV的异质性比例是8% (range, 0.3 to 88) ，生存分析显著。

然后795个驱动突变事件里面，219个都是亚克隆的，多位点取样测序能显著提高发现驱动事件的比例。

2017-BMC Medical Genomics-1个61岁男性胃癌患者的6个肿瘤样品

Zhou, Z., Wu, S., Lai, J., Shi, Y., Qiu, C., Chen, Z., … Chen, S. (2017). Identification of trunk mutations in gastric carcinoma: A case study. BMC Medical Genomics, 10(1), 1–8. https://doi.org/10.1186/s12920-017-0285-y
首先指出和肯定ITH在精准医疗时代的重要性，所以测了1个61岁男性胃癌患者的6个肿瘤样品的全外显子，发现382个ns点突变，其中：

• 35 trunk mutations (54.97%, 210/382)
• 17 branch mutations (16.84%, 64/382),
• 108 private mutations (28.27%, 108/382).
  
  最后的结论是trunk的VAF比branch高
  值得一提的是作者下载了2014发表在science的LUAD的多位点取样原始数据走他自己的数据分析流程，个人觉得，纯粹是因为自己的数据太少了。

  2017- Journal of Hepatology-5个HCC患者的32个肿瘤部位

  Huang, A., Zhao, X., Yang, X. R., Li, F. Q., Zhou, X. L., Wu, K., … Zhou, J. (2017). Circumventing intratumoral heterogeneity to identify potential therapeutic targets in hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology, 67(2), 293–301. https://doi.org/10.1016/j.jhep.2017.03.005
  包括Whole exome sequencing (WES) and targeted deep sequencing (TDS) were 两个测序技术，异质性如下：
  
  最后文章的亮点可能是：Circulating cell-free DNAs (cfDNAs)
  
  外显子实验的平均测序深度超200，这5个病人共1220个体细胞突变，涉及581个基因，比较了Whole exome sequencing (WES) and targeted deep sequencing (TDS)技术的差异。
  

  2017-Annals of Oncology-4个CRC病人的28个肿瘤部位

  Wei, Q., Ye, Z., Zhong, X., Li, L., Wang, C., Myers, R. E., … Yang, H. (2017). Multiregion whole-exome sequencing of matched primary and metastatic tumors revealed genomic heterogeneity and suggested polyclonal seeding in colorectal cancer metastasis. Annals of Oncology, 28(9), 2135–2141. https://doi.org/10.1093/annonc/mdx278
  对原位癌症和转移癌症部分都取样测序，进化树如下：
  
  说明了CRC的转移是polyclonal seeding机制，

  2017-BMC Cancer-2个肾癌患者的9个肿瘤部位

  Liu, M., Liu, Y., Di, J., Su, Z., Yang, H., Jiang, B., … Su, X. (2017). Multi-region and single-cell sequencing reveal variable genomic heterogeneity in rectal cancer. BMC Cancer, 17(1), 1–11. https://doi.org/10.1186/s12885-017-3777-4
  测序策略：9 tumor regions and 88 single cells from 2 rectal cancer patients，重点应该是单细胞基因组测序看拷贝数变异。
  
  从 single nucleotide variations (SNVs) and somatic copy number alterations (SCNAs) 角度来看异质性
  然后单细胞基因组测序用的是multiple an- nealing and looping-based amplification cycles (MALBAC)。

• a Clustered heatmap of 24 single tumor cells with SCNA profiles in patient 1 based on Euclidean distance and ward.D method.
• b Clustered heat map and PCA of 35 single tumor cells of patient 2 based on SCNA profiles. Single tumor cells were grouped into two clusters.
• c Subclonal SCNAs of patients 1 and 2 divided single tumor cells into two subpopulations, which was in accordance with two clusters identified by PCA. The
  
  因为只有两个病人，所以肯定会细致的比较两个病人的区别。

  2017-Oncotarget-两个MANEC病人的多位点

  两个病人分开分析，因为样本量太小，所以非常细致的探索了它们的方方面面，外显子测序平均测序深度高达350，而且还针对目标突变进行高深度的捕获测序，大于1000X的，拷贝数变异的量化使用的是Illumina Human
  OmniZhongHua-8 BeadChips。 测序数据都是可以下载的SRP079168
  取样如下：
  
  突变比较如下：
  
  绘制进化关系图如下：
  

  2018-NC-16个LUAD病人的79个肿瘤区域

  Nahar, R., Zhai, W., Zhang, T., Takano, A., Khng, A. J., Lee, Y. Y., … Tan, D. S. W. (2018). Elucidating the genomic architecture of Asian EGFR-mutant lung adenocarcinoma through multi-region exome sequencing. Nature Communications, 9(1). https://doi.org/10.1038/s41467-017-02584-z
  LUAD的多位点取样早在2014的science文章就发表了，而且2017的新英格兰关于TRACERx计划也涉及到了LUAD。 所以本文的重点是Asian EGFR-mutant LUAD
  纳入16个病人的79个肿瘤区域样品，分析肿瘤异质性高达60%，远超于之前2014科学杂志的研究报道的30%。
  
  还比较了吸烟和不吸烟的LUAD病人的肿瘤进化区别：
  

  2018-Journal of Hepatology-6个ICC病人的69个PDPC部位

  前面已经有发表在2017- Journal of Hepatology-的5个HCC患者的32个肿瘤部位的研究，本研究侧重于ICC，取PDPCs: patient-derived primary cancer cells; 进行 WES 测序。病人来源于复旦大学中山医院。
  结果 肿瘤异质性高达60%，而且超过85%的驱动突变都是branch的.
  

  2018-89个ccRCC患者的178个肿瘤样品

  Moore, A. L., Kuipers, J., Singer, J., Burcklen, E., & Schraml, P. (2018). Intra-tumor heterogeneity and clonal exclusivity in renal cell carcinoma. BioRxiv, 1–43. https://doi.org/10.1101/305623
  测序策略：89个ccRCC患者的178个肿瘤样品测序。
  第一期纳入16个病人，每个病人取2个肿瘤样品进行全外显子测序和转录组测序，近40%的异质性。
  第二期对全部的89个病人，捕获826个基因进行高深度测序。
  
  文章提到了一个 GeneAccord 的算法可能有帮助。
  

  2018-NC-10个早期肠癌患者的53个肿瘤部位

  Saito, T., Niida, A., Uchi, R., Hirata, H., Komatsu, H., Sakimura, S., … Mimori, K. (2018). A temporal shift of the evolutionary principle shaping intratumor heterogeneity in colorectal cancer. Nature Communications, 9(1), 1–11. https://doi.org/10.1038/s41467-018-05226-0
  作者在2016有ACRC的队列的多位点看异质性的研究，这次纳入10个早期肠癌患者的53个肿瘤部位进行外显子测序，命名为PCRCs队列继续看肿瘤异质性。
  A是advance，P是precancerous lesions
  两个队列区别很大：
  
  提出CRC的进化模型：
  

  2018-CCR-11个TNBC病人的78个肿瘤样品

  Barry, P., Vatsiou, A., Spiteri, I., Nichol, D., Cresswell, G. D., Acar, A., … Sottoriva, A. (2018). The spatiotemporal evolution of lymph node spread in early breast cancer. Clinical Cancer Research, 24(19), 4763–4770. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-17-3374
  对11个TNBC病人取样78进行肿瘤测序，包括原位癌和淋巴结转移的样品，如下：
  
  3种测序手段都用上了：

• whole-exome sequencing (WES),
• whole-genome sequencing (WGS),
• targeted deep sequencing
  高达75%的异质性，如下：
  
  同样的也纳入了ctDNA相关数据

  2019-NC-39个ESCC患者的185个肿瘤样品

  Yan, T., Cui, H., Zhou, Y., Yang, B., Kong, P., Zhang, Y., … Cui, Y. (2019). Multi-region sequencing unveils novel actionable targets and spatial heterogeneity in esophageal squamous cell carcinoma. Nature Communications, 10(1). https://doi.org/10.1038/s41467-019-09255-1
  测序策略：纳入 39个ESCC患者的185个肿瘤样品，平均测序深度高达300，发现ITH平均高达65%
  
  多位点取样这个策略，可以发现的驱动事件要多于单个样品。
  然后进化模型每个病人都不一样：
  

非整倍体是癌症的特征之一，但是关于癌症发生发展期间二倍体基因组如何演变为非整倍体的研究仍然是不够，所以发表于Nat Genet. 2016 Oct; 的文章的作者纳入了12个TNBC病人，测了他们的1000个单细胞基因组序列。来探索是否应该是 punctuated copy number evolution (PCNE) 模型。
不到3年的时间，就收获了150多个引用，还不错。

FACS实验可以把细胞分成4类

分别是： diploid (D), hypodiploid (H), aneuploid (A) or universal (U).

两种CNA理论

左图理论描述了基因组的拷贝数的扩增和缺失是渐变的，循序渐进，所以从正常的二倍体基因组到最恶性的非整倍体基因组之间应该是有一些过渡情况。
而右图理论描述了二倍体基因组在得到一个压力而获得拷贝数的扩增和缺失之后，就丧失了继续不稳定的能力，而是不停的扩大第一次变异的那种状态。
如下：

12个TNBC病人情况

他们的临床资料，见文章附件，这里展示它们的细胞数据量：

在病人体内没有发现过渡状态

如下，可以看到，在T1这个病人的所有单细胞里面，要么是二倍体，要么是一种非整倍体状态：

所有病人的1000个单细胞那些非整倍体细胞都可以分成3个主克隆类

使用PAM分类算法，每个病人都可以分成1~3类克隆细胞亚群，而A,B,C 这3类细胞比例如下：

每个病人的二倍体细胞和非整倍体细胞泾渭分明

其中一个病人如下：

可以清晰看到它们的界限：

病人之所以分成不同克隆亚群，是因为有少量基因的CNV状态不一样，如下：

对T3这个病人来说，他的A,B两个亚克隆就是少量基因的拷贝数区别。

不同病人的非整倍体细胞各有各的不同

前面每个病人内部的单细胞可以比较明显的区分成为不同的亚群克隆，但是把所有病人放在一起就会出现病人之间的差异要大于病人内部亚群的差异现象。
如下：

后记

单细胞新秀navin课题组研究，数据非常的精彩，恰好说明了TNBC的CNV发展是爆发式的，而且是提供原始数据的，200G左右，附件还给出了代码，主要是找CNV的代码，理论上可以很好的复现该研究。
感兴趣的朋友可以试试看。

本研究发表于 Nat Commun. 2019 Apr ，题目是：Multi-region sequencing unveils novel actionable targets and spatial heterogeneity in esophageal squamous cell carcinoma. 纳入 39个ESCC病人，然后取肿瘤样品 185个，146个原位癌症样品和21个淋巴结转移样品。不仅仅是肿瘤外显子测序，还有一些TCR测序。
其实并不是食管癌的第一篇文章了，之前有发表在 Nat Genet. 2016 Dec; 的研究就纳入13个ESCC病人，对51个肿瘤部位做WES测序，而且还挑选其中3个病人做了甲基化芯片数据来探索食管癌的肿瘤内部突变的时空异质性。

　关于肿瘤外显子测序

包括　39 normal esophageal tissues and 164　regional tumors from 39 patients, 21 metastatic lymph nodes samples and PBMCs　from 10 patients
值得注意的是，还有在　WuXi NextCODE　的　５０８个ＷＧＳ测序数据哦，这个数据并没有独立发表文章，　但是在本研究中作为验证集数据。

主要的数据分析策略

发现有些软件我也没有用过，不过跟我这几年走的肿瘤外显子流程大同小异：

点突变的全景图

这里作者把病人的突变分成了branch和trunk，然后挑选了5个基因集的重要基因进行可视化如下：

拷贝数变异的全景图

同点突变，可视化如下：

根据拷贝数变异推断病人的克隆进化情况

这里拿ESCC033举例：

branch和trunk突变的频谱关联情况

非负举证分解可以把突变根据cosmic的30个频谱进行分类打分。
可以看到branch突变数量是跟APOBEC频谱正相关，而trunk突变跟aging频谱负相关。

它们的8个频谱比例不一样，如下：

外显子队列和全基因组队列都有部分病人是BRCA1基因缺陷

COSMIC的signature 3和 BRCA1/2缺陷的关系早就在多种癌症有报道，因为本39个ESCC队列发现了4例病人有着 pathogenic germline alterations in BRCA1/2 genes ， 所以作者认为这个可能是靶点，值得继续探索，最后也的确发现COSMIC的signature 3比例的确可以揭示病人的 BRCA1/2 基因缺陷情况。
如下：

而且可以看到病人的COSMIC的频谱3比例是可以很好的预测病人是否携带有BRCA1基因缺陷的。

平行进化模型

最后得到了：

前面我们介绍过卵巢癌领域的第一个类器官研究，发表于 September 13, 2018，题目是：Prediction of DNA Repair Inhibitor Response in Short Term Patient-Derived Ovarian Cancer Organoids 研究者共成功制备了33 organoid cultures derived from 22 HGSC patients ，但是做的数据分析很少，常规的WES+RNA测序数据，而且做的是短期培养，最后研究者从IHC结果还有SNV/CNV全景图来说明病人的肿瘤样品与其培养的类器官匹配情况。数据在phs001685.v1.p1需要申请才能下载。
这次我们要介绍的是卵巢癌领域的第二个类器官研究，发表于 Nat Med. 2019 Apr ，是类器官领域大名鼎鼎的Hans Clevers研究组，建立卵巢癌病人的组织进行类器官培养体系，作者们总共从32个不同病人组织建立了56个类器官品系。并且通过对于类器官细胞的形态学以及免疫组化染色，确认了类器官与病人组织切片的特征有着很好的一致性。

卵巢癌完整分类

参考： April 2019 https://doi.org/10.1038/s41591-019-0422-6

• borderline tumors (BTs; non-carcinoma) 约占15%
  • primarily of serous BT (SBT)
  • mucinous BT (MBT) subtypes
• type I (carcinomas)
  • low-grade serous (LGS)
  • mucinous(MC)
  • endometrioid (END)
  • clear cell (CCC) carcinomas
• type II tumors (carcinomas)
  • high-grade serous (HGS) tumors
    HGS的来源：
• fimbria of the fallopian tube (FT)
• surface epithelium (OSE)
  

  本研究纳入的卵巢癌样本分类情况

  涵盖了几乎全部的卵巢癌亚型，如下：
  

  相似性问题

  一般类器官研究都需要证明类器官与病人组织切片的特征有着很好的一致性，如下表：
  
  虽然有少部分病人的类器官跟其原位癌症的突变对不上，但是总体上来说，一致性是非常的好：
  
  同样的，拷贝数变异也是这样的结果。

  首先是CNV相似性

  使用control-free-C软件对WGS数据找CNV，相似性很明显：
  

  然后是SNV的相似性

  跟他们实验室2018的乳腺癌文章一样，仅仅是展示感兴趣基因的突变一致性。
  

  转录组数据看相似性

  全文就放了一个相关性热图：
  
  感觉Hans Clevers研究组一直把NGS数据当做是一个辅助其科研的实验手段，仅仅是做最基本的分析而已，就是为了说明类器官及其来源的病人的癌症样本的一致性而已。

  药物处理情况

  既然是药物处理，必然有敏感人群和不敏感的， 根据IC50聚类如下：
  
  可以看到，药物处理反应情况可以比较好的分成两组，按照道理，这个时候可以对这两个组别进行差异分析等等，来寻找药物相关基因集，不过这个很显然不是作者的重点。

  多部位取样

  有趣的是，这里作者涉及了一点肿瘤内部异质性的概念，可以看到对同一个病人的不同癌症部位取样测序，它们的异质性存在，相似性也有。
  

  单细胞全基因组

  细胞数量不多，因为单细胞研究还是比较前沿的，看起来Hans Clevers研究组也是才开始这方面建设。
  不同病人的癌症部位和类器官都有二倍体细胞和非整倍体细胞。
  

  850K甲基化芯片数据

  这里也很简单，仅仅是挑选那些在样本中变化比较大的一万多个探针的信号值矩阵进行计算相关性而已。

  Heat map of five independent organoid lines from both early and late passages based on 11,720 methylation probes. The heat map colors represent Pearson correlation values, as calculated from the methylation beta-values
  看相关性：
  

通常多组学就是全外显子和转录组而已，这个规律早就提现在了各个国家地区的队列之中，本研究也不例外，发表在：Nat Commun. 2019 Apr，是中国肺癌研究领域比较出名的吴一龙课题组

队列病人情况

非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌都有，总共245个患者，命名为 CHOICE 队列，如下：

CHOICE队列和TCGA队列的非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌的拷贝数变异的比较

主要就是比较TCGA队列的非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌的GISTIC2算法得到的amplification 和 deletions和中国人的队列的差异，展现如下；

这样的比较可以有四次。

CHOICE队列和TCGA队列的非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌的点突变比较

点突变跟拷贝数变异不一样，并没有去区分扩增和缺失，所以只需要区分鳞癌和腺癌比较两次即可，如下：
突变全景图和突变频率最高的30个基因的区别如下：

免疫浸润情况

因为有转录组数据，所以可以推测免疫浸润的各种免疫细胞比例，然后可以比较非小细胞肺癌的鳞癌和腺癌的差异，如下：

也可以比较吸烟和不吸烟的群体的差异。

使用ssGSEA算法计算26 immune cell types比例

这26个基因集来源于文章 Immunity. 2013 Oct ， 分类如下；

• 11个是adaptive immunity
• 12个是 for innate immunity
• 3个是 for MDSC，angiogenesis, and antigen presentation machinery
  使用GSVA包的ssGSEA算法，对z-score后的RNA-seq表达矩阵进行分析。有趣的是作者提供了RPKM矩阵哦，The RNA-seq FPKM data have been deposited at figshare (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.7306364.v1). 所以理论上可以重现作者的分析。
  可以把病人分成3组不同的免疫状态，主要是看 IFNG, PD-L1, PD-1, and CD8 基因的表达，如下：
  
  然后分组后可以比较他们的突变表现， 从SNV,CNV角度来看，然后发现PTEN和PIK3CA的表达量跟T细胞指标有相关性。
  

昨天我们提到了任意更改基因表达分组阈值生存分析结果大不一样：https://mp.weixin.qq.com/s/pQL8jA38gDPO5xVDG0L94w

看到https://www.proteinatlas.org/ENSG00000111801-BTN3A3/pathology/tissue/breast+cancer

文字版是：

Based on the FPKM value of each gene, we classified the patients into two groups and examined their prognoses.

In the analysis, we excluded genes with low expression, i.e., those with a median expression among samples less than FPKM 1.

The prognosis of each group of patients was examined by Kaplan-Meier survival estimators, and the survival outcomes of the two groups were compared by log-rank tests.

To choose the best FPKM cut-offs for grouping the patients most significantly, all FPKM values from the 20th to 80th percentiles were used to group the patients, significant differences in the survival outcomes of the groups were examined and the value yielding the lowest log-rank P value is selected.

得到的K-M图如下：

如果是在 http://www.oncolnc.org/ 出图如下：

a=read.csv('BRCA_10384_50_50.csv')
head(a)
a$event=ifelse(a$Status=='Alive',0,1)
library(survival)
library(survminer)
sfit <- survfit(Surv(Days, event)~Group, data=a) 
ggsurvplot(sfit, conf.int=F, pval=TRUE)

phe=a
phe$time=phe$Days/365

## 批量生存分析 使用 logrank test 方法
mySurv=with(phe,Surv(time, event))
log_rank_p <- lapply(2:8, function(i){
 thr=sort(phe$Expression)[round(nrow(phe)*i/10)]
 phe$group=ifelse(phe$Expression > thr,'high','low') 
 print(table( phe$group ))
 data.survdiff=survdiff(mySurv~group,data=phe)
 p.val = 1 - pchisq(data.survdiff$chisq, length(data.survdiff$n) - 1)
 return(p.val)
}) 
log_rank_p=unlist(log_rank_p)
log_rank_p

i=8
thr=sort(phe$Expression)[round(nrow(phe)*i/10)]
phe$group=ifelse(phe$Expression > thr,'high','low') 
print(table( phe$group ))
sfit <- survfit(Surv(time, event)~group, data=phe) 
ggsurvplot(sfit, conf.int=F, pval=TRUE)

遗憾的是，因为数据源不一样，使用oncolnc的数据也不太可能画出 proteinatlas 一模一样的图：

见：https://mp.weixin.qq.com/s/pQL8jA38gDPO5xVDG0L94w

很久以前我们提到过TCGA的各种网页数据库的生存分析结果冲突的问题，现在又有人提出来一个新的问题，如下：

根据基因表达量的中位值把样本分成高低表达量的组别，然后做差异分析是比较符合大家的直觉的。
如果这个时候生存分析结果不具有统计学显著性，而大家又的确感兴趣这个基因在这个癌症的临床意义，会尝试调整分组指标，这也就是为什么网页工具会提供调整阈值的窗口，比如调整为如下所示：

你会惊奇的发现，显著了！！！
但是实际上这样30%的阈值来进行分组的操作一定会受到审稿人质疑，基本上没有人这样操作，如果调整我25%的阈值就会发现马上又不显著了。
所以这样的KM分析是有弊端的！

那COX分析呢

COX分析就是排除一下样本其它信息的干扰之后的生存分析，这个时候网页工具能做的很有限，我们需要下载临床数据在R里面完成这个分析，如果你看了我的视频，就应该是知道至少下面两个临床信息是值得信赖的。

• https://gdc.xenahubs.net/download/TCGA-BRCA/Xena_Matrices/TCGA-BRCA.GDC_phenotype.tsv.gz
• TCGA-CDR https://api.gdc.cancer.gov/data/1b5f413e-a8d1-4d10-92eb-7c4ae739ed81
  打开Rstudio，接下来就开始我们的表演吧！
  
  首先制作网页工具同样的图：

  a=read.csv('BRCA_5163_50_50.csv')
  head(a)
  a$event=ifelse(a$Status=='Alive',0,1)
  library(survival)
  library(survminer)
  sfit <- survfit(Surv(Days, event)~Group, data=a) 
  ggsurvplot(sfit, conf.int=F, pval=TRUE)
  

  出图如下：
  
  读者朋友们这里可以尝试写一个循环，看看不同阈值分组的生存分析的统计学P值如何。
  接下来读入临床信息，做COX分析，这个时候需要对临床信息有非常深刻的认识，毕竟临床记录动辄都是几百种信息。
  挑选几个自己觉得值得探索的因素去做COX分析，继续看不同分类标准后的基因表达量分组是否生存分析具有统计学显著性。
  代码参考：https://github.com/jmzeng1314/tcga_example/blob/master/scripts/step04-batch-coxp.R

  那区分亚型呢

  对BRCA的亚型，可以在 https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/panimmune 里面下载到
  文件是：Annotated TCGA Subtypes by Noushmehr and Malta - TCGASubtype.20170308.tsv

• https://api.gdc.cancer.gov/data/0f31b768-7f67-4fc4-abc3-06ac5bd90bf0
  那，有了这些文件，很容易写代码去探索不同亚型内部该基因是否具有KM或者COX的生存分析的统计学显著性。

为了分析不同类型、组织起源肿瘤的共性、差异以及新课题。TCGA于2012年10月26日-27日在圣克鲁兹，加州举行的会议中发起了泛癌计划。参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6000284/ 为此我也录制了系列视频教程在：TCGA知识图谱视频教程（B站和YouTube直达）
发表于普通杂志：Mol Cancer Res. 2019 Feb; 文章是：Molecular Correlates of Metastasis by Systematic Pan-Cancer Analysis Across The Cancer Genome Atlas. 系统性的研究了TCGA数据库的11种癌症的 4,473 primary tumor samples and 395 tumor metastasis samples ，发现不同癌症的 转移和原位癌的表达差异都很大，不同癌症有一些overlap情况，当然除了比较mRNA-seq数据，还有miRNAs,RPPA, DNA methylation 的数据的比较探索。还利用了 Gene expression data (TPM values) from GTEx Analysis version 7 数据库，也有一些GEO数据库的，比如GSE110590。
文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html

差异表达

样本量如此悬殊，作者居然也做了差异分析

作者采用了多种统计学算法来寻找差异基因：

不同癌症的上下调基因的overlap情况如下：

不同癌症的上下调基因集的overlap情况：

TCGA数据库和GEO数据库的比较

如下：

蛋白质芯片数据的泛癌比较

RPPA proteomic data involved 218 features and four cancer types (BRCA, PCPG, SKCM, and THCA) with metastasis profiles.
下面是其中一个例子，蛋白和编码其的基因都是显著差异

miRNA表达数据的泛癌比较

For each cancer type examined, the correlations with metastasis for RPPA (Reverse Phase Protein Array) and microRNA features represented in TCGA. Also included are mRNA:microRNA pairings, as defined by both a previously identified miRNA-target interaction (as cataloged by miRTarBase Release 7.0) and significant differential expression in metastasis (FDR<0.1) for both mRNA and microRNA, in opposite directions from each other (mRNA up:microRNA down or mRNA down:microRNA up).

DNA甲基化芯片数据的泛癌比较

For each cancer type, top metastasis-associated DNA methylation CpG Island features, selected using Pearson’s correlation (logit-transformed values) with Storey and Tibshirini estimate of False Discovery Rate (FDR) of <10%. Differential mRNA statistics (metastasis versus primary) corresponding to the associated genes are also included.
主要关注：CpG Islands (by Illumina 450K array, 150K CpG Island probes)
图展示差异甲基化位点和差异表达基因的overlap情况，如下；

定下 metastasis signature

这里并没有使用 miRNAs,RPPA, DNA methylation 的数据，就是纯粹的mRNA-seq数据来获得的 metastasis signature

A set of 821 genes were found significant (FDR < 10%) with same direction of change for two or more cancer types

生存分析说明临床意义

比较奇怪的是，这里并没有展示作者自己的821个基因的metastasis signature 在TCGA的生存分析效果，反而是用前列腺癌的GEO数据。
The TCGA-derived prostate cancer metastasis signature in particular could define a subset of aggressive primary prostate cancer.

补充材料

• Supplementary Information - Supplementary Figures and Description of Data Files
• Table S1 - TCGA cancer cases and molecular profiles examined in this study.
• Table S2 - For all genes represented in TCGA RNA-seq datasets, the mRNA-level correlations with metastasis for each cancer type.
• Table S3 - For each cancer type, top metastasis-associated mRNA features, selected using Pearson’s correlation on log-transformed data with Storey and Tibshirini estimate of False Discovery Rate (FDR) of <10%.
• Table S4 - Gene Ontology (GO) term associations for the top metastasis-associated genes for each cancer type.
• Table S5 - For each cancer type examined, the correlations with metastasis for RPPA (Reverse Phase Protein Array) and microRNA features represented in TCGA.
• Table S6 - For each cancer type, top metastasis-associated DNA methylation CpG Island features, selected using Pearson’s correlation (logit-transformed values) with Storey and Tibshirini estimate of False Discovery Rate (FDR) of <10%. Differential mRNA statistics (metastasis versus primary) corresponding to the associated genes are also included.
  

  后记

  从流程图来看，本研究并不复杂，也很容易复现出来， 关键是如何提出还有如何挑选数据集。
  本文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html

为了分析不同类型、组织起源肿瘤的共性、差异以及新课题。TCGA于2012年10月26日-27日在圣克鲁兹，加州举行的会议中发起了泛癌计划。参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6000284/ 为此我也录制了系列视频教程在：TCGA知识图谱视频教程（B站和YouTube直达）
本研究发表于 Clin Cancer Res. 2018 Aug ，题目是：A Pan-cancer Landscape of Interactions between Solid Tumors and Infiltrating Immune Cell Populations. 系统性的研究了 9,174 tumors of 29 solid cancers 的免疫浸润情况。这些免疫数据都是可以在 https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/panimmune 下载的。本来我以为这篇文章做的很简单，以为下载 panimmune 数据就好，但是看了文章的附件，我才知道，我想的简单了。
文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html

免疫浸润背景知识

肿瘤微环境主要由肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞、细胞外基质、多种生长因子、炎症因子及特殊的理化特征（如低氧、低pH）和癌细胞自身等共同组成，肿瘤微环境显著影响着肿瘤的诊断、生存结局和临床治疗敏感性。微环境中的细胞可以聚成不同类别，而每种细胞与其他细胞间同时存在复杂又显著的相互作用，而且存在一些稳健的细胞浸润模式。
通过免疫组织化学染色或CIBERSORT方法评估免疫细胞浸润。基于LASSO Cox回归模型，从22种免疫特征中选择5种免疫特征构建免疫型。
本文系统性的评估了3个免疫微环境文献，提出来了自己的16个免疫成分的微环境。

数据量情况

16种免疫细胞浸润情况

作者选择自己使用GSVA算法，流程如下：

其中GSVA和ssGSEA算法

一致性不错：

为什么选择16个基因集

这里作者参考了3篇文章：

• (1) Bindea et al. (2013)
• (2) Angelova et al. (2015)
• (3) Charoentong et al. (2017)
  然后还做了两个验证：
• 在CCLE数据库的RNA-seq数据集验证
• 在GSE86362数据集Affymetrix 133 Plus 2.0 芯片数据验证
  把TCGA的BRCA癌症里面的TNBC样本去除后的 924个乳腺癌表达数据的GSVA结果如下：
  
  根据不同cytotoxic含量可以把癌症样本分成6个immunophenotypes
  其它癌症的immunophenotypes分布情况：
  

  TCGA和GTEx的比较

  使用到的GTEx数据如下：
  

  ESTIMATE 和CIBERSORT 结果的比较

  首先 CIBERSORT 算法对 TCGA数据的 芯片和测序表达量推断的免疫细胞组分结果一致性并不好。
  所以作者修改了算法，把RNA-seq测序数据转换后适合CIBERSORT 算法，这样相关性就很不错了，如下：
  
  不同颜色代表不同免疫细胞组分的比例。

  不同immunophenotypes激活的通路不一样

  前面说到作者根据不同cytotoxic含量可以把癌症样本分成6个immunophenotypes，这个是全文的核心发现，接下来就可以比较不同的immunophenotypes群体的区别。
  

  附件

• Supplementary Material - Supplementary Methods, Supplementary Note, and Supplementary Figures
• Table S1 - Gene sets representing immune cell populations and cell pathways
• Table S2 - Details of the meta-processes employed (in Figure 4) in the description of tumor development in the three scenarios of immune infiltration
• Table S3 - Pan-cancer and per-cancer type GSVA scores for immune populations
• Table S4 - Immune-phenotypes
• Table S5 - Enrichment for somatic driver alterations across tumor immune-phenotypes
• Table S6 - Association of somatic driver alterations with immune populations
• Table S7 - Results of the GSEA enrichment
  

  后记

  本文是研究肿瘤免疫的最佳学习素材，尤其是70多页的附件，满满的知识点，希望大家学的开心！
  本文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html

为了分析不同类型、组织起源肿瘤的共性、差异以及新课题。TCGA于2012年10月26日-27日在圣克鲁兹，加州举行的会议中发起了泛癌计划。参考：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6000284/ 为此我也录制了系列视频教程在：TCGA知识图谱视频教程（B站和YouTube直达）
发表于 Dev Dyn. 2018 Mar;的研究，题目是：Pan-cancer survey of epithelial-mesenchymal transition markers across the Cancer Genome Atlas. 系统性的分析了32个癌症的一万个病人的数据，主要集中于 16-gene signature of canonical EMT markers 跟前面的 Sci Rep. 2013 Oct 和 Nat Commun. 2014 Sep ，还有 Nucl Receptor Res. 2015 Dec 类似的地方，都是研究固定有生物学意义的基因集。
这16个基因是：13 mesenchymal marker genes (VIM, CDH2, FOXC2, SNAI1, SNAI2, TWIST1, FN1, ITGB6, MMP2, MMP3, MMP9, SOX10, GCS) and three epithelial marker genes (CDH1, DSP, OCLN).
文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html

EMT背景知识

上皮细胞-间充质细胞转化（EMT）——上皮肿瘤细胞失去黏附能力获得间充质细胞迁移性能力以促进转移和耐药性的过程，EMT程度不同的细胞就会呈现出不同的转移性质。
皮肤癌和乳腺癌组织中至少存在7中EMT状态不同的癌细胞亚群：从完全上皮化（分化）到完全的间充质化（未分化）状态，中间是各种杂化状态。参考：Identification of the tumour transition states occurring during EMT, Nature (2018)

全局看EMT表达热图

可以看到EMT基因的表达量异质性：

不同的EMT打分算法的相关性

EMT scores based on part A (referred to here as the “Creighton” EMT signature, as previously featured in (Creighton et al., 2013)) with EMT scores based on another previously published signature by Byers et al. (Byers et al., 2013).
如下图：

还算是比较一致。

EMT得分和肿瘤纯度的相关性

这里作者选择了 “Creighton” EMT signature来代表EMT，跟肿瘤纯度是负相关。

所以作者又检查了这EMT基因集里面的基因之间的表达量相关性，校正肿瘤纯度前后看区别。

EMT基因和转录因子相关基因的表达量相关性

An initial set of 377 genes with Gene Ontology annotation of “transcription factor complex” or “transcription factor binding” were selected
有107个基因跟EMT signature score相关性很高，

EMT基因和肿瘤免疫相关基因的表达量相关性

首先看重要的免疫靶点，如下：

然后可以在XCELL下载64种免疫指数，然后计算相关性

生存分析

这16个基因的EMT值，高的EMT值非常显著的与坏的生存相关，而且是跨越癌症种类的。

后记

从流程图来看，本研究并不复杂，也很容易复现出来，后面我们会在GitHub公布数据复现的代码。
本文献解读属于100篇泛癌研究文献系列，首发于：http://www.bio-info-trainee.com/4132.html